전체 글 (24) 썸네일형 리스트형 200902 cell culture Cell stock 푼 것을 이제 culture할 때가 됐다. 정확한 명칭은 subculture라고 한다. 시작하기전에 media는 미리 water bath에 뎁혀두고 현미경으로 cell 상태가 괜찮은지 관찰한다. Cell을 키울 때 중요한 2가지 요인이 있는데 하나는 nutrient(영양; cell 종류마다 알맞는 media가 다르다)이고 다른 하나는 confluence(공간)이다. Confluence의 경우 cell이 얼마나 빽빽히 자라느냐를 의미하고, culture를 해줄 때 원래 기존 passage의 cell 중 얼만큼을 다음 passage에 넘겨 키울 것이냐를 결정해야한다. 이번에 키우는 cell은 일반적으로 기존 passage의 cell 중 30%가량을 다음 passage로 키우는데 이번엔 c.. 200902 접종 어제 incubation끝난 plate를 4도(냉장고)에 보관했다가 접종할 때 꺼내와준다. 총 6개의 15ml tube에 접종해줄 것이다. 이런 접종의 경우 최대 12개의 tube에 접종해서 실험을 진행할 수 있다. 지금의 경우 USP6 하나만 보는거지만 샘플이 서너개되면 각 샘플당 tube 3~4개 접종하면 된다. Contamination 최소화를 위해 알코올 램프를 켜고 시작한다. 1. Premix 만들기: tube당 액체LB(-/-) 2ml + Amp(1000x) 2ul >> 액체LB 13ml + Amp 13ul LB plate에는 Amp가 있지만 액체LB에는 없으므로 Amp를 넣어줘야 한다. Zipel 냉동실에 있으니 꺼내서 녹여주고 그동안 tube에 naming을 해준다. 액체LB는 저번에 미리.. 200901 Media change 월요일날 cell stock을 풀어줬던 것의 media를 한 번 바꿔주는 과정이다. 1. Media는 미리 water bath에 뎁혀둔다. 2. Cell을 꺼내서 현미경으로 상태를 한 번 봐준다. 3. Clean bench에서 media를 suction Suction기에 팁을 꽂은 채로 해준다. Plate 뚜껑을 연 뒤 plate를 살짝 기울여서 팁이 plate 바닥에 안닿게 한다. 바닥에 닿으면 cell이 찢어질 수 있다. 팁을 plate의 벽에 붙여서 하면 된다. 가능하면 빨리 하는 것이 좋지만 익숙하지 않다면 천천히 한다. 4. 새 media 10ml를 넣어준다. 이 때도 plate를 기울여 팁이 plate바닥에 닿지 않게 팁을 plate 벽에 대고 천천히 media를 넣어준다. 5. Plate는 .. 200901 Transformation Overnight으로 ligation까지 모두 다했다면 이것을 E.coli에 집어넣어줄 것이다. 이 과정을 transformation이라고 한다. Ligation까지 다 된 것에는 ligation이 성공적으로 된 vector도 있겠지만 성공하지 못한 vector도 함께 섞여있을 것이다. Ligation이 성공된 vector를 selection하여 그 vector를 얻기 위해 이 과정을 거친다. Transformation을 거친다고 100% ligation이 성공한 vector만을 얻을 순 있는건 아니지만 원하는 vector를 가질 확률이 높아진다. 1. Ice를 스티로폼 박스에 퍼온 뒤 competent cell(DH5a strain E.coli)을 옆방 냉동고 아랫칸에서 꺼내온다. Competent c.. 200831 cell stock 풀기 곧 cell culture를 해야되기 때문에 cell stock부터 푸는 것을 배웠다. 이번에 사용할 cell은 MDA-MB231 cell로 malignant breast cancer이며 culture하기가 쉬워서 cell culture연습용으로 쓰기에 적합하다. Stock은 P0또는 P1의 passage가 얼려진 fresh한 상태를 의미하고, P1의 stock을 풀어 P2 passage의 cell을 키우기 시작한다. 보통 P1 stock 하나로 P2 10개를 만들 수 있으며, 가지고 있는 P1 stock이 하나밖에 안남았으면 P2를 만들어서 P2를 stock으로 쓰게된다. P1 ● ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ (stock) ↓stock 풀기 P2 ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ ㅇ 이 P2로 cul.. 200831 Enzyme cut/Ligation 석사1기 개강했다. 저번주에 USP6 PCR하고 gel내리고 purification까지한 것과 pMSCV vector를 RE로 enzyme cut하고 pMSCV vecor와 ligation시켜야한다. 우선 sample들을 4도에 보관시키기 위해 스티로폼 박스에 아이스를 퍼담아와서 철 렉을 꽂아주고 냉장고에 USP6와 vector를 꺼내준다. 문제는 vector 농도가 tube에 naming되어있지가 않아서 농도를 모른다... 그래서 일단 농도를 재줬다. 1. 0점처럼 기준이 되어줄 blank로는 D.W. 100ul, 농도 구하려는 sample은 vector 1ul+D.W. 99ul로 희석 2. Blank와 sample spin down 3. Photometer와 프린트기 전원 켜기 > dsDNA클릭 4... 200826 PCR/agarose gel/gel electrophoresis/DNA purify 어제 primer가 모두 도착해서 잘 녹여주고 냉동실에 넣어놨었다. 오늘 그래서 할 일은 pcr을 돌린 뒤 agarose gel에서 전기영동을 하고 gel에서 dna를 purification하는 것이다. 우선 필요한 것들이 냉동되어있는 상태면 꺼내서 녹여놔야한다. 1. 스티로폼박스에 ice 담아오기 2. primer, template DNA를 냉동실에서 꺼내서 multi mixer에 돌리면서 녹이기 3. 냉동실에서 PCR star buffer, dNTP mixture 꺼내와서 상온에 녹이기 4. Ice에는 철 렉 꽂아두기 10~20분가량 둬서 녹였던 것 같다. 모두 준비됐으면 PCR돌릴 용액을 만들면 된다. *최종volume: 25ul 1. D.W. - 13ul D.W. volume은 정해졌다기보단 최종.. 200826 pcr하기 어제 primer가 모두 도착해서 잘 녹여주고 냉동실에 넣어놨었다. 오늘 그래서 pcr을 돌렸다. 우선 필요한 것들이 냉동되어있는 상태면 꺼내서 녹여놔야한다. 1. 스티로폼박스에 ice 담아오기 2. primer, template DNA를 냉동실에서 꺼내서 multi mixer에 돌리면서 녹이기 3. 냉동실에서 PCR star buffer, dNTP mixture 꺼내와서 상온에 녹이기 4. Ice에는 철 렉 꽂아두기 10~20분가량 둬서 녹였던 것 같다. 모두 준비됐으면 PCR돌릴 용액을 만들면 된다. *최종volume: 25ul 1. D.W. - 13ul D.W. volume은 정해졌다기보단 최종vol(25ul)에서 2~7번 용액들 volume 총합을 뺀 만큼 넣어준다. 2. Buffer(5x) - .. 200820,21,24_USP6 내 석사 프로젝트 주제가 정해졌다. USP6(ubiquitin specific protease 6)는 deubiquitination 기능을 가진 단백질인데, 사람과 일부 고진화된 종(고릴라, 침팬지 등)에서만 발견된다고 한다. 마우스에도 없다고 한다. 그래서 USP6를 클로닝해서 다양한 human cell line에 과발현시켜 어느 cell line에서 가장 높은 발현을 보이는지 확인하고, 또 마우스에도 발현시켜서 기존에 비해 어떤 변화가 생기는지 보려고 한다. Knock-in시켜 gain of function을 보는 실험이라고 한다. 전제척인 실험 개요는 USP6를 pMSCV-puro vector에 cloning -> 293FT cell(transfection효율과 cell growth가 높음)에 tr.. 200818 PCR primer 짜기 A. FBXO38 gene이 있는 plasmid를 가진 E.coli를 고체LB배지에 배양해서 single colony를 얻는다. B. Single colony를 따서 액체LB배지에 접종하고 배양한다. C. 배양액에서 plasmid만 추출해 얻는다.(midi prep) D. Plasmid의 FBXO38 gene을 다른 vector에 옮긴다.(subcloning) E. FBXO38 gene을 옮겨준 새 vector를 cell에 transfection 시킨다. 8월 18일 Subcloning하기 전 FBXO38 gene을 PCR을 통해 증폭시켜줘야한다. PCR을 하기 위해선 primer가 필요한데 primer를 어떻게 만드느냐에 따라 PCR의 효율이 달라진다고 한다. 그래서 오늘은 primer를 짜는 방법을 .. 이전 1 2 3 다음
