200826 PCR/agarose gel/gel electrophoresis/DNA purify

어제 primer가 모두 도착해서 잘 녹여주고 냉동실에 넣어놨었다.

오늘 그래서 할 일은 pcr을 돌린 뒤 agarose gel에서 전기영동을 하고 gel에서 dna를 purification하는 것이다.

 

우선 필요한 것들이 냉동되어있는 상태면 꺼내서 녹여놔야한다.

 

 

<PCR준비_해동>

1. 스티로폼박스에 ice 담아오기

2. primer, template DNA를 냉동실에서 꺼내서 multi mixer에 돌리면서 녹이기

3. 냉동실에서 PCR star buffer, dNTP mixture 꺼내와서 상온에 녹이기

4. Ice에는 철 렉 꽂아두기

 

10~20분가량 둬서 녹였던 것 같다. 모두 준비됐으면 PCR돌릴 용액을 만들면 된다.

 

 

<PCR mix 준비>

*최종volume: 25ul

 

1. D.W. - 13ul

   D.W. volume은 정해졌다기보단 최종vol(25ul)에서 2~7번 용액들 volume 총합을 뺀 만큼 넣어준다.

2. Buffer(5x) - 5ul

   최종 volume이 25ul이므로 5ul를 넣어주면 1x가 된다.

3. dNTP musture - 2.5ul

   농도 2.5mM/ul 기준(각 base종류별로 2.5mM/ul의 농도라는 의미임)

4. DMSO - 1ul

   DNA의 꼬인 구조를 풀어주는 역할을 함

5. Template DNA - 1ul

   내가 갖고있던 농도 = 964ng/ul >> 희석해서 100ng/ul로 만들어준 뒤 1ul 첨가

   희석: template DNA 1ul + D.W. 8.6ul

6. Primer - foward, reverse 각 1ul

   농도: 100pmol/ul >> 희석해서 10pmol/ul로 만들어준 뒤 각 1ul 첨가

   희석: primer 10ul + D.W. 90ul

7. Taq Pol - 0.5ul

 

PCR tube에 1~7번을 순서대로 넣어준 뒤 잘 섞이도록 피펫팅 조금 해주면 된다.

앞쪽 물질은 순서가 약간 바껴도 크게 상관은 없지만 Taq pol은 꼭 마지막에 넣어줘야한다.

 

 

<PCR 돌리기>

 

1. PCR 기계 전원 on하고 PCR tube는 spin down 시킨다.

2. PCR 기계 화면에 save protocol>user name 선택>PCR 선택

3. Annealing 온도 변경: primer design했을 때 구한 Tm값 입력

4. Extension 시간 변경: DNA size에 따라 다름

   DNA size는 CDS검색하면 ㅇㅇㅇㅇ~ㅁㅁㅁㅁ(숫자)가 CDS 부위라고 뜬다. 내가 돌리는 DNA는 2637~6657이 CDS라고 해서 총 길이는 4221bp이다. DNA 1kb당 1분이라고 생각하고 계산하면 되므로 extension time은 4.221분 = 약 4분 20초가량이다. 

5. 런

 

보통 35~40cycle을 돌린다는데 이건 40cycle을 돌린다고 한다.

PCR 시작했더니 4시간이나 해야된다고 떴다. 끝날 때까지 기다려야한다...

 

PCR이 모두 끝났으면 PCR 산물이 제대로 있는지 확인하기 위해 agarose gel에 전기영동을 해야한다.

그 전에 PCR 산물은 꺼내보면 살짝 습기가 차있는데 손으로 살짝 tapping해준 뒤 spin down을 해주고 얼음에 꽂힌 렉에 꽂아서 보관해둔다.

 

 

<Agarose gel (1%) 만들기>

 

( ) 안에 있는 양은 좀 더 많은 양을 만들 때를 가정한건데, 비율만 맞춰서 만들면 된다. Agarose 가루의 양이 TAE buffer의 1% 양이면 된다. 무게를 잴 때 엄청 정확할 필요는 없음.

비닐장갑을 끼는 이유는 TAE buffer와 EtBr등이 있는 구역이 EtBr때문에 위험하기 때문이다. EtBr이 발암성 물질이라고 들었는데 따라서 가급적이면 이것을 다루는 구역은 맨손이 닿지 않도록 하고 다른 구역을 만질 때에도 장갑을 끼고벗는 것에 유의해야 한다. (장갑낀채로 다른 책상이나 물건을 만져서도 안된다.)

 

1. Agarose 가루 0.2g(0.3g)을 삼각 플라스크에 넣는다.

2. 비닐장갑을 끼고 실린더에 1x TAE buffer 20ml(30ml)를 삼각 플라스크에 넣는다.

3. 살살 흔들어준 뒤 삼각 플라스크 입구를 랩으로 씌우고 안쓰는 팁으로 구멍을 뽕뽕 뚫어준다.

4. 삼각 플라스크를 전자레인지에 돌린다. 약 1분정도 돌리면 되는데 적당히 끓으면 빼도 된다. 뺀 후 식혀준다.

5. 식히는 동안 gel을 굳히는 틀(흰색 큰 틀과 검은색 작은 틀)과 홈을 내주는 틀을 깨끗이 닦아준다. 홈을 내주는 틀은 흰색 큰 틀에 꽂히는 부분만 깨끗해도 크게 상관없다. 흰색 큰 틀에 검은색 작은 틀을 꽂아준다.

6. 삼각 플라스크가 어느정도 식으면(손으로 만졌을 때 뜨뜻미지근하면 ㅇㅋ) EtBr을 2ul정도 넣어주고 살살흔들어준 뒤 틀에다가 부어준다. 거품과 기포가 없어지도록 쓱쓱 닦아준 뒤 홈을 내주는 틀을 끼워준다.

이 상태로 10분 정도 냅두면 agarose gel이 굳어서 말랑말랑한 젤리처럼 된다.

 

<Gel electrophoresis 겔전기영동>

 

전기영동을 할 때 loading dye(6x)와 marker dye(1kb)를 쓸 것이다.

-EtBr: gel을 내린 후 UV를 쬈을 때 DNA를 detection할 수 있도록 DNA 중간에 끼어든다.

-Loading dye: loading되는 것을 보여줌. 어떻게 써야 표현이 잘될지를 모르겠는데... DNA자체를 보여주는 것이 아니라 어디까지 전개가 됐는지 보여주는 역할을 한다. 

-Marker dye(1kb): Size를 알려주는 역할을 한다. Western blotting에서 protein ladder와 똑같은 역할을 한다고 생각하면 된다. 1kb 크기까지 알려줄 수 있다. 각 band마다의 size는 랩실 벽에 붙어있으니 참고하면 된다.

 

1. Agarose gel이 모두 굳으면 전기영동 틀 내의 중간 선까지 TAE buffer를 넣는다.

2. Agarose gel을 담은 검은색 작은 틀을 통째로 들어 틀 겉을 휴지로 닦아준 뒤 전기영동 틀에 꽂는다.

3. PCR산물(25ul)이 들은 tube에 loading dye 5ul(6x였으니 최종산물에서 1x가 되도록 5ul첨가)을 넣고 피펫팅해준다.

4. Agarose gel에 나있는 홈 중 가장 윗쪽 홈에 marker dye 3ul를 넣어준다.(=홈에 넣는 것을 loading한다고 표현한다)

   홈에 팁을 잘 조준해 꽂아서 홈에 물질이 차게 해주면 된다. 참고로 이것을 하고 있는 구역이 EtBr 구역이라 책상에 피부가 닿지 않도록 유의해준다.

5. 3에서 만든 것을 다른 홈에 loading시킨다.

   3의 최종 volume은 30ul이다. volume이 큰 피펫을 쓰면 한번에 홈에 넣을 수 있겠지만 팁이 얇고 작은 것을 사용하는 것이 더 정확하게 조준이 잘 되므로 가장 작은 10ppm 피펫으로 3번에 나눠서 한 홈에 다 넣어준다. 또 이번 경우엔 어차피 loading할게 이것밖에 없으니 marker dye를 loading시킨 곳 바로 옆에 할 필요는 없고 한 칸 떨어진 곳에서 해주면 나중에 gel을 자를 때 편하다. 만약 여러 물질을 gel에 내릴 땐 어쩔 수 없이 따닥따닥 loading시키는 수 밖에...

6. 전선을 꽂은 뒤 파워를 틀에 꽂고 안전장치뚜껑을 덮은 후 기다린다.

   10~15분정도 후에 보면 band가 슬금슬금 내려와있는게 보인다. 보통 gel 중간 쯤 왔을 때 전기영동을 끝낸다. 이번같은 경우엔 일반적인 케이스보다 dna size가 좀 큰 편이라 중간보다 더 많이 내려왔을 때 전기영동을 껐다. 결과물 UV 사진을 찍기 위해 UV용 노트북을 미리 켜둔다.

 

 

<Detection; UV>

 

Gel을 만질 때와 detection 방 문고리 잡을 땐 무조건 장갑을 끼고 그 외 대부분 상황에선 장갑을 꼭 벗은 채로 물건을 사용해야한다.

 

1. 전기영동이 끝났으면 검은색 작은 틀을 꺼내서 겉에 묻는 buffer를 잘 닦아준다.

2. 장갑을 뺀 후 UV detection 기계를 연다. 다시 장갑을 끼고 틀을 기계 안 바닥 위에서 살살 세워 gel을 뺀다.

3. 다시 장갑을 뺀다. 노트북 바탕화면의 카메라가 연결된 프로그램을 켜서 빛을 8~15초 모아서 찍는 것을 설정하여 사진을 찍는다. 카메라가 위잉 돌아가는 소리가 나야한다.

4. UV사진을 보면 marker dye와 dna band가 보인다. 그것을 통해 대략적인 dna의 size를 파악할 수 있다. 정확한 정량은 못하지만 rough하게 어느정도 크기겠구나를 알 수 있다.

 

대충 알맞는 size의 DNA band가 나왔음이 확인됐으면 gel에서 그 DNA만을 따로 뽑아낼 필요가 있다.

 

 

<DNA purification>

 

우리 랩실 아주 안 쪽에 detection 방이라고 어두컴컴하고 uv lamp가 있는 방이 있다. 그 방으로 가야한다. 가기전에 비닐장갑을 끼고 장갑 안에 새 ep tube를 넣어주고(tube는 EtBr과 닿으면 안된다) gel을 들고 간다. Detection 방 문고리는 장갑낀채로 만지니까 맨손으로는 만지지 않도록 한다. 

Detection 방 오른쪽에 UV lamp를 키고 뚜껑을 열어서 그 위에 gel을 둔다. UV 또한 몸과 눈에 좋지 않기에 몸은 가림막 역할을 하는 뚜껑 뒤에만 있도록 하고 gel을 볼때도 뚜껑을 통해 보도록 한다. (그래도 UV과 완벽히 차단되는 것은 아니니 너무 오래 보지 않도록 한다) 칼날로 DNA band부위를 네모낳게 잘라준 뒤 장갑 안에 갖고왔던 ep tube에 쏙 넣어준다. Ep tube는 장갑낀채로 만지지 않도록 조심한다.(한쪽 장갑을 뺀 채로 해도 될듯..)

 

이제 키트를 이용해 고체인 gel을 액체처럼 녹이고 거기서 DNA만 빼낼 것이다. 사용하는 키트는 Mega quick plus DNA purification kit이다. 그 전에 gel을 담은 ep tube의 무게를 미리 재주고 incubator를 55도로 미리 셋팅해 켜둔다. Incubator는 detection방 들어가기 전에 켜놔도 될듯.

 

1. BNL 용액(buffer 녹이는 역할)을 gel 무게의 3배만큼 넣어준다.

   저울을 통해 미리 재본 결과 gel은 100mg가량이였고 따라서 BNL 용액을 300ul 넣어줬다.

2. 1에서 만든 혼합액을 55도 incubator에 5분간 꽂아 녹여준다. 꺼내서 tapping했을 때 불투명한 아지랑이같은게 안보이고 투명했을 때 완전히 다 녹은 상태이다.

3. 그동안 DNA filter column을 준비해둔다. 큰 tube에 filter가 있는 tube를 꽂으면 된다.

4. 2에서 다 녹은 용액을 spin down시킨 뒤 피펫으로 모두 따서 column에 넣고 column을 13000rpm/1min centrifuge.

5. 4가 끝난 후 suction

6. Washing buffer 700ul첨가 후 13000rpm/1min centrifuge. Washing buffer를 쓰기 전 통 겉면에 EtOH에 체크표시가 있는지만 확인해준다.

7. 6이 끝난 후 suction

8. 13000rpm/1min centrifuge(column dry 단계)

9. 새 ep tube를 꺼내서 filter있는 column을 꽂는다. 원래 꽂았던 큰 tube는 버려도 됨.

10. D.W. 48ul를 흰색 filter가 적셔지도록 한방울씩 떨어뜨리고 1분간 기다린 후 13000rpm/2min centrifuge.

     나중에 enzyme cut할 때 43ul가 필요한데 넉넉하게 48ul를 넣어준 것이다.

11. Filter column은 버리고 tube는 냉동보관한다.