내 석사 프로젝트 주제가 정해졌다.
USP6(ubiquitin specific protease 6)는 deubiquitination 기능을 가진 단백질인데, 사람과 일부 고진화된 종(고릴라, 침팬지 등)에서만 발견된다고 한다. 마우스에도 없다고 한다. 그래서 USP6를 클로닝해서 다양한 human cell line에 과발현시켜 어느 cell line에서 가장 높은 발현을 보이는지 확인하고, 또 마우스에도 발현시켜서 기존에 비해 어떤 변화가 생기는지 보려고 한다. Knock-in시켜 gain of function을 보는 실험이라고 한다.
전제척인 실험 개요는
USP6를 pMSCV-puro vector에 cloning
-> 293FT cell(transfection효율과 cell growth가 높음)에 transfection
-> cell에서 retro virus 생성
-> cell 깨고 나온 virus를 얻어서 human or mouse tissue cell line에 infection
-> western blotting으로 flag detection
-> RNA sequencing/mass...
293FT cell에 transfection시킬 vector는 USP6 gene이 없는 vector/USP6 gene 있는 vector/CI mutant USP6 gene 있는 vector 이렇게 3가지를 사용할 것이다. CI mutant란 catalytic inhibition의 줄인말로 알고 있는데 deubiquitination 주제가 정해졌다.
USP6(ubiquitin specific protease 6)는 deubiquitination 기능을 가진 단백질인데, 사람과 일부 고진화된 종(고릴라, 침팬지 등)에서만 발견된다고 한다. 마우스에도 없다고 한다. 그래서 USP6를 클로닝해서 다양한 human cell line에 과발현시켜 어느 cell line에서 가장 높은 발현을 보이는지 확인하고, 또 마우스에도 발현시켜서 기존에 비해 어떤 변화가 생기는지 보려고 한다. Knock-in시켜 gain of function을 보는 실험이라고 한다.
전제척인 실험 개요는
USP6를 pMSCV-puro vector에 cloning
-> 293FT cell(transfection효율과 cell growth가 높음)에 transfection
-> cell에서 retro virus 생성
-> cell 깨고 나온 virus를 얻어서 human or mouse tissue cell line에 infection
-> western blotting으로 flag detection
-> RNA sequencing/mass...
293FT cell에 transfection시킬 vector는 USP6 gene이 없는 vector/USP6 gene 있는 vector/CI mutant USP6 gene 있는 vector 이렇게 3가지를 사용할 것이다. CI mutant란 catalytic inhibition의 줄인말로 알고 있는데 deubiquitination시키는 효소 활성이 없는 mutant라고 생각하면 된다.
pMSCV-puro vector를 298FT cell에 transfection 시키면 vector에 삽입시킨 gene을 가진 retro virus가 생긴다. 이 retro virus를 cell line에 infection시키면 target gene이 cell의 염색체에 삽입될 수 있고, 이렇게 하면 stable한 over expression cell line을 얻을 수 있다. (단순히 vector를 바로 cell line에 transfection시키면 vector는 나중에 degradation되기 때문에 stable한 overexpression cell line을 얻긴 힘들다, 보통 이런 것은 transient하다고 표현한다.)
우선 cloning을 하기 위해선 USP6 gene을 PCR해야하고, 그러기 위해선 primer가 필요하다. pMSCV-puro vector에 맞게 REsite를 고려해서 primer를 만들어줘야되는데 여기까지의 단계는 이전 글에 보면 찾아보면 있음. 내가 이번에 한 건 XhoI, HpaI RE site를 사용하면 됐다. 또 RE site의 앞뒤서열도 어떻게 있냐에 따라 RE효율이 달라지므로 참고해준다.
Primer는 foward방향과 reverse 방향이 필요하다. Vector map에 보면 XhoI이 HpaI보다 앞쪽에 위치해서 foward에 XhoI을, reverse에 HpaI 서열을 추가할 것이다. 또 이 vector map을 보면 Kozac site가 존재하지 않아 foward primer에는 kozac site도 넣어줘야 한다. 나중에 western할 때 flag같은 tag를 사용해야 하는데, 이 서열도 vector에 없어서 primer에 추가시켜야 한다.
Foward primer: 5' RE site + Kozac + Flag epitope + target gene 서열 5' 시작부분(약18~22bp) 3'
Reverse primer: 5' RE site + target gene 서열 3'부분의 상보서열(약18~22bp) 3'
target gene과 직접적으로 binding하게 되는 부분은 약 18~22bp정도의 길이로 해주는 것이 좋고 Tm은 60도 내외로 맞춰주는 것이 좋다. GC%는 40~60%로 맞춰주는 것이 좋은데... Tm을 맞추다보면 GC%까지 완벽히 맞추기는 힘들긴하다. Tm은 foward와 reverse 둘 다 거의 일치하도록 해주는 것이 좋다.
Primer 디자인이 끝났으면 ㅁ크로젠에 들어가서 주문시킨다. 서열이 길면 오래걸린다...
Primer는 tube안에 담겨서 온다. 우선 이 primer를 녹여야하기 때문에 배송올 때 같이 딸려온 종이에 있는 표를 참고해(vol for 100pmol/ul에 써진 만큼 DW넣어주면됨) 3차 D.W.를 넣어주고 tapping해준다. 그 뒤에 centrifuge에 spin down을 시켜주고 흔들거리는 multi mixer에 꽂아 한시간정도 돌려준 뒤 -20도에 냉동보관을 해준다.