200831 cell stock 풀기

곧 cell culture를 해야되기 때문에 cell stock부터 푸는 것을 배웠다.

이번에 사용할 cell은 MDA-MB231 cell로 malignant breast cancer이며 culture하기가 쉬워서 cell culture연습용으로 쓰기에 적합하다.

 

Stock은 P0또는 P1의 passage가 얼려진 fresh한 상태를 의미하고, P1의 stock을 풀어 P2 passage의 cell을 키우기 시작한다. 보통 P1 stock 하나로 P2 10개를 만들 수 있으며, 가지고 있는 P1 stock이 하나밖에 안남았으면 P2를 만들어서 P2를 stock으로 쓰게된다.

 

P1  ●  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ (stock)

     ↓stock 풀기

P2  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ  ㅇ

     이 P2로 culture와 실험을 시작하게 된다.

 

Culture를 시작할 땐 P2 passage의 cell을 P0라고 다시 명명해서 부르게 되고, culture를 한 번씩 진행할 때마다 P1, P2, P3....식으로 passage가 올라간다. 뭐든지 그렇지만 cell 또한 너무 오래 키우면 fresh하지 않아 상태가 아주 좋지 않기 때문에 (사람마다 다르긴 하지만) 보통 P7~P10쯤에서는 cell을 버리고 새 stock을 풀어 다시 실험을 진행한다.

 

P0 →culture→ P1 →culture→ P2 →culture→...→culture→ P7(새stock 풀 때가 됐음)

 

Cell을 키울 땐 3가지 요소가 필요하다.

1) Media(이번엔 DMEM/High glucose media 사용): cell이 자랄 때 필요한 영양분有

2) FBS 혈청(9%): Growth factor, 호르몬 등이 있어 cell이 성장할 수 있도록 신호를 보냄

3) Antibiotics(penicillin, streptomycin 등): 균 감염을 최소화시킴

 

 

<Cell stock 풀기>

 

1. Media를 냉장고에 꺼내서 water bath에 넣고 30분간 뎁힌다.

  Water bath는 흰색 렉이 안잠길 정도로만 물을 채워넣어준다. 물은 안쪽 싱크대의 1차 D.W.를 사용한다.

2. Stock 받침대(incubator옆 서랍에 파란색 렉)을 챙기고 옆방 액체질소탱크에서 cell stock을 꺼내온 뒤 stock을 water bath에서 3분간 녹여준다.

3. 클린벤치 안에서 15ml tube에 naming을 해준 뒤 media 4ml + cell stock 전부(1ml)를 넣어주고 centrifuge (①1000rpm/3min/25도)

   클린벤치 밖에 있던 물건들은 클린벤치 안에 들어가기 전에 에탄올로 한번 닦아준 뒤 클린벤치 안으로 넣어주고 cell stock은 tube에 넣기 전 미리 피펫팅해준다.

   15ml tube에 media와 cell stock을 넣어준 뒤 tube의 용액 약간을 stock tube에 옮겨 피펫팅해준 뒤 다시 15ml tube에 넣어준다. 혹시 남아있을 cell을 모두 가져오기 위해 하는 듯함.

4. 100파이 plate에 naming을 해준 뒤 media 10ml를 넣어준다.

5. Centrifuge가 끝난 3을 pellet만 남도록 suction해준 뒤 plate에 넣어둔 media 1ml를 옮겨 거품이 안나도록 조심이 피펫팅 해준다. 피펫팅을 너무 빨리 하거나 모든 용액을 빨거나 뿜어내지 않게 해준다.

6. 5를 plate에 풀고 위 아래 대각선 방향으로 살살 흔들어준다. 방향을 바꿀 때마다 잠깐 멈춰주면서 살살 흔들면 된다.

7. Plate를 incubator에 넣어준다.

8. 클린벤치 정리; suction기는 에탄올로 한번 suction해주고 클린벤치 바닥과 뚜껑을 ethanol로 닦아주고 피펫 충전기에 꽂아두기

 

Cell을 바로 plate에 풀어버리지 않고 굳이 centrifuge에 돌려서 media를 버리고 다시 plate에 풀어주는 단계를 거치는 이유는... cell stock에는 DMSO라는 물질이 섞여있는데 DMSO는 cell에 독성이 있는 물질이라 culture할 때 없는 것이 좋아서 DMSO를 제거하기 위해 이런 과정을 거친다. DMSO는 cell이 너무 얼지 않도록 해준다고 한다.