200901 Transformation

Overnight으로 ligation까지 모두 다했다면 이것을 E.coli에 집어넣어줄 것이다. 이 과정을 transformation이라고 한다. Ligation까지 다 된 것에는 ligation이 성공적으로 된 vector도 있겠지만 성공하지 못한 vector도 함께 섞여있을 것이다. Ligation이 성공된 vector를 selection하여 그 vector를 얻기 위해 이 과정을 거친다. Transformation을 거친다고 100% ligation이 성공한 vector만을 얻을 순 있는건 아니지만 원하는 vector를 가질 확률이 높아진다.

 

 

<Transformation>

 

1. Ice를 스티로폼 박스에 퍼온 뒤 competent cell(DH5a strain E.coli)을 옆방 냉동고 아랫칸에서 꺼내온다.

   Competent cell은 transformation이 잘 되도록 cell wall을 변형시킨 cell을 의미하고, 우리 랩실에서 쓰는 DH5a strain은 plasmid copy를 많이 만들 수 있는 E.coli strain이다.

2. 알코올램프를 켠 뒤(contamination 최소화) competent cell 100ul를 ligation을 마친 tube에 넣고 피펫팅, ice에서 10min 기다림

3. 2가 끝나면 tube를 스티로폼렉에 꽂고 옆방의 42도 water bath에 1분 30초간 넣는다. (Heat shock)

   대충 어떤 원리냐면 plasmid형태의 vector가 아주 차가울 때(2번 과정) E.coli 표면에 붙어있다가 heat shock(3번)을 주면 E.coli 내부로 들어가게 되는 것이다. 물론 100%되는건 아니지만 누군가는 됐을 것이라 생각하고 진행한다.

4. Water bath에서 꺼낸 뒤 ice에 꽂고 10min 기다림.

   그동안 랩실 문 옆 냉장고에 있는 액체LB를 꺼내 준비한다.

   액체LB stock은 오염되어선 안되기 때문에 직접 피펫 팁을 넣으면 안된다. 따라서 알코올램프 주변에서 stock을 15ml tube에 조금 덜어둔 뒤에 덜어둔 LB를 사용한다. LB stock 뚜껑은 닫기 전 불에 한번 살짝 대주고 뚜껑을 닫아준다.

5. LB 300ul를 4가 끝난 tube에 넣어주고 스티로폼렉에 꽂은 채로 shaking incubator에 1시간 incubate시킨다.

   그동안 zipel냉장고 서랍에서 LB plate(Amp有)를 꺼내둔다.

6. 5가 끝나면 3000rpm/3min centrifuge.

   그동안 plate에 naming, 알코올램프 불 켜두기, ep tube 새거 하나 준비

7. 6이 끝난 것 중 350ul를 따서 ep tube에 버리고 남은 용액과 pellet을 피펫팅으로 풀어준다.

8. 7을 LB plate에 3번 정도 나눠서 떨어뜨린 후 유리막대로 골고루 펴준다.

   유리막대는 사용 전 에탄올에 적시고 불에 그을린 뒤 식혀준다. 유리막대를 plate에 뗐을 때 뭉치는 느낌이 없을 때까지 문질러주면 된다. 7에서 350ul를 버리는 이유는 버리지 않고 모두 plate에 바르면 한참을 발라야하기 때문에 액체LB 일부를 버리고 pellet(E.coli)와 약간 남은 LB만을 plate에 발라주기 위함이다.

모두 발라 펴줬으면 plate뚜껑을 불에 살짝 그을리고 plate를 덮어준다. 유리막대도 에탄올+불로 소독한다.

9. 옆방 37도 incubator에 12~14시간 incubation

   다음날 꺼내와야할 시간까지 계산해서 언제 incubator에 넣을지 잘 생각해야한다. 저녁8시쯤 넣으면 다음날 아침 10시쯤 꺼내면 되는데 아무생각없이 저녁 5시에 넣으면 다음날 아침 6~7시에 plate를 빼러와야하는 대참사가 벌어진다. Incubator에서 plate를 꺼낸 뒤 colony가 자란 정도를 보고 1~2시간정도 더 incubation을 시킬수도 있다.