200831 Enzyme cut/Ligation

석사1기 개강했다.

저번주에 USP6 PCR하고 gel내리고 purification까지한 것과 pMSCV vector를 RE로 enzyme cut하고 pMSCV vecor와 ligation시켜야한다. 우선 sample들을 4도에 보관시키기 위해 스티로폼 박스에 아이스를 퍼담아와서 철 렉을 꽂아주고 냉장고에 USP6와 vector를 꺼내준다.

 

문제는 vector 농도가 tube에 naming되어있지가 않아서 농도를 모른다... 그래서 일단 농도를 재줬다.

 

 

<Spectrophotometer로 미지의 농도 구하기>

1. 0점처럼 기준이 되어줄 blank로는 D.W. 100ul, 농도 구하려는 sample은 vector 1ul+D.W. 99ul로 희석

2. Blank와 sample spin down

3. Photometer와 프린트기 전원 켜기 > dsDNA클릭

4. 파이펫을 100ul보다 많게 설정(130~140정도)후 blank를 큐벳에 옮겨담기

5. 큐벳을 photometer에 꽂고(투명한 벽이 화살표에 오게) blank 클릭, 다되면 빼기

6. Blank 액체를 큐벳에서 빼고 sample 넣은 뒤 기계에 꽂기

7. Dilution 클릭 > sample 1ul + D.W. 99ul 입력 > sample 클릭

이렇게하면 sample의 농도가 희석배수까지 고려해 계산되어서 나온다. 즉 희석하기 전 원래 vector의 농도값이 나온다.

이 결과 내가 가진 vector는 2806.4ug/ml 라고 나왔다.

 

 

<Buffer찾기>

RE가 잘 작용할 수 있도록 환경을 조성해줄 buffer로 어떤 것을 쓸지 찾아준다.

 

1. 접속: international.neb.com/

Reagents For the Life Sciences Industry | NEB

2. 상단의 tools&resources > double digest finder 들어가서 사용하려는 RE 검색 후 결과확인

   이번엔 XhoI, HpaI을 쓰기로 했으니 두 개를 찾아넣었고 그 결과 CutSmart를 쓰라고 나왔다.

   참고로 첫 표의 % Activity in NEBuffer는 해당 buffer를 넣었을 때의 RE 활성 정도를 나타낸다고 한다.

 

 

<Enzyme cut>

 

USP6는 가진 것 모두 enzyme cut할 예정이고 vector는 1ug 자를 예정이다. 1ul가 아니라 1ug이다.

또 incubator를 미리 37도로 셋팅해둔다. (전원on > set > 온도 설정 > set 2번 누르기)

 

1. 새 ep tube 2개(하나는 USP6/하나는 vector)와 buffer(이 경우엔 cutsmart; zipel에 보관중), RE(zipel 보관)

   Zipel은 그냥 우리 랩실에 있는 냉장고 이름이당..

2. USP6 tube: USP6 43ul + buffer(10x) 5ul + enzyme 종류별로 1ul씩 // 총 50ul

3. vector tube: vector 1ug + buffer(10x) 1ul + enzyme 종류별로 1ul씩 + D.W. // 총 10ul 

   실험할 때마다 사용하는 vector 농도가 다를 수 있기 때문에 1ug이 되는 양만큼의 volume을 넣어준 후 총 volume이 10ul가 되도록 D.W.를 추가적으로 넣어주면 된다. 아까 농도를 재봤을 때 2806.4ug/ml였으므로 1ul당 약 2.8ug있다는 뜻이고, 1ug이 되도록 하려면 1/2.8=약 0.357ul이 필요하다.

   하지만 아무리 작은 파이펫을 써도 0.357ul을 따는 것은 무리이므로 vector를 10배 희석(vector 1ul + D.W. 9ul)해서 3.57ul를 따기로 했다. 그럼 D.W.는 추가적으로 3.43ul 넣어주면 된다.

4. 각 tube를 피펫팅해주고 spin down 시킨다.

5. 37도에 맞춰둔 incubator에 tube를 꽂고 2~3시간 기다린다. 그럼 그 사이에 RE가 USP6와 vector를 싹둑 자를 것이다.

 

 

<Ligation>

 

Enzyme cut이 다 됐으면 template DNA(USP6)와 vector가 붙을 수 있도록 붙여줘야하는데 이것이 ligation 단계이다.

일단 incubator에서 USP6와 vector tube를 꺼내고 incubator는 16도로 세팅한다.

 

1. Enzyme cut이 끝난 tube를 spin down 시키고 MEGAquick spin plus kit를 준비한다.

   지금 tube 안에는 DNA뿐만아니라 여러가지 buffer와 enzyme이 섞여있는 상태이므로 DNA만 purification해야한다.

2. Kit의 column을 2개(USP6, vector) 준비하고 naming (column: filter있는 tube를 큰 tube에 꽂으면됨)

3. 각 tube내의 volume의 5배 되는 양의 BNL 용액을 넣고 피펫팅

   USP6는 50ul였으므로 BNL을 250ul 넣어주고 vector는 10ul였으니 BNL 50ul을 넣어준다.

4. 3을 각각 모두 따서 column에 옮긴 뒤 column을 centrifuge(13000rpm/1min) 후 큰 tube suction

   그동안 zipel에서 T4 DNA ligase buffer를 꺼내서 녹여둔다. (위치: 곰그려진 PCR enzyme있는 통)

5. 두 column 모두 Wash buffer 700ul 넣은 후 centrifuge(13000rpm/q1min), 큰 tube suction

6. Column dry: centrifuge(13000rpm/1min) ; 그 사이에 ep tube 2개 새거 준비한 뒤 naming해두기

7. 준비한 ep tube에 filter있는 column 빼서 꽂은 뒤 3차 D.W. 20ul를 filter에 한방울 씩 떨어뜨리고 1분간 기다리기

8. Centrifuge (13000rpm/2min) 후 filter column은 버려도 됨

9. 새 ep tube 1개 준비한 뒤(naming까지 하기) 8에서 나온 template DNA(USP6) 7.5ul + vector 0.5ul + T4 DNA ligase buffer(10x) 1ul + T4 DNA ligase enzyme 1ul 넣어주기; 최종volume 10ul

   Enzyme은 zipel 곰상자에 있고 PCR때와 마찬가지로 가장 마지막 순서에 넣어준다. 미리 빼둘 필요없이 넣기 직전에 꺼내와서 넣어주면 된다. Template DNA와 vector를 넣어주는 양은 사실 농도계산을 다 해서 넣어줘야되긴 하는데 하나하나 다 하기 힘드니까 이 랩실에서는 대충 7.5:0.5 비율로 넣으면 가장 ligation이 잘 된다고 판단해서 이 비율로 넣게 됐다고 한다.

10. 9를 피펫팅해주고 spin down 시킨 뒤 미리 16도로 세팅했던 incubator에 overnight