200826 pcr하기

어제 primer가 모두 도착해서 잘 녹여주고 냉동실에 넣어놨었다.

오늘 그래서 pcr을 돌렸다. 우선 필요한 것들이 냉동되어있는 상태면 꺼내서 녹여놔야한다.

 

<PCR준비_해동>

1. 스티로폼박스에 ice 담아오기

2. primer, template DNA를 냉동실에서 꺼내서 multi mixer에 돌리면서 녹이기

3. 냉동실에서 PCR star buffer, dNTP mixture 꺼내와서 상온에 녹이기

4. Ice에는 철 렉 꽂아두기

 

10~20분가량 둬서 녹였던 것 같다. 모두 준비됐으면 PCR돌릴 용액을 만들면 된다.

 

 

<PCR mix 준비>

*최종volume: 25ul

 

1. D.W. - 13ul

   D.W. volume은 정해졌다기보단 최종vol(25ul)에서 2~7번 용액들 volume 총합을 뺀 만큼 넣어준다.

2. Buffer(5x) - 5ul

   최종 volume이 25ul이므로 5ul를 넣어주면 1x가 된다.

3. dNTP musture - 2.5ul

   농도 2.5mM/ul 기준(각 base종류별로 2.5mM/ul의 농도라는 의미임)

4. DMSO - 1ul

   DNA의 꼬인 구조를 풀어주는 역할을 함

5. Template DNA - 1ul

   내가 갖고있던 농도 = 964ng/ul >> 희석해서 100ng/ul로 만들어준 뒤 1ul 첨가

   희석: template DNA 1ul + D.W. 8.6ul

6. Primer - foward, reverse 각 1ul

   농도: 100pmol/ul >> 희석해서 10pmol/ul로 만들어준 뒤 각 1ul 첨가

   희석: primer 10ul + D.W. 90ul

7. Taq Pol - 0.5ul

 

PCR tube에 1~7번을 순서대로 넣어준 뒤 잘 섞이도록 피펫팅 조금 해주면 된다.

앞쪽 물질은 순서가 약간 바껴도 크게 상관은 없지만 Taq pol은 꼭 마지막에 넣어줘야한다.

 

<PCR 돌리기>

1. PCR 기계 전원 on하고 PCR tube는 spin down 시킨다.

2. PCR 기계 화면에 save protocol>user name 선택>PCR 선택

3. Annealing 온도 변경: primer design했을 때 구한 Tm값 입력

4. Extension 시간 변경: DNA size에 따라 다름

   DNA size는 CDS검색하면 ㅇㅇㅇㅇ~ㅁㅁㅁㅁ(숫자)가 CDS 부위라고 뜬다. 내가 돌리는 DNA는 2637~6657이 CDS라고 해서 총 길이는 4221bp이다. DNA 1kb당 1분이라고 생각하고 계산하면 되므로 extension time은 4.221분 = 약 4분 20초가량이다. 

5. 런

 

보통 35~40cycle을 돌린다는데 이건 40cycle을 돌린다고 한다.

PCR 시작했더니 4시간이나 해야된다고 떴다. 끝날 때까지 기다려야한다...