분류 전체보기 (24) 썸네일형 리스트형 qPCR primer design qPCR primer를 만들어봅시다 1. NCBI에서 qPCR을 통해서 보고자 하는 gene을 검색을 한다. 예시는 PTPN13이라는 gene이다. 2. 종(Species)을 확인하고 클릭 3. protein&mRNA 확인, NM_숫자 클릭 (transcript variant가 여러개인 경우 longest variant인 것으로 선택) 4. FASTA 클릭(형광표시된 부분 클릭) 5. 우측 상단의 Send to 누른 후 fasta file 저장(컴퓨터에 fasta 확장명으로 파일이 저장됨) 6. 써ㅁ피셔 oligo perfect 사이트(apps.thermofisher.com/apps/oligoperfect/#!/design)에서 로그인 후 End-point PCR 클릭 7. Enter sequences .. 201023~28 RNA isolation / qPCR TGF beta를 친 T cell을 모아서 T cell의 RNA를 뽑아내고, qPCR을 돌려서 gene들의 발현 정도를 확인할 것이다. qPCR은 mRNA를 cDNA로 합성(역전사)한 뒤 그 cDNA를 가지고 PCR을 돌려서 소프트웨어 프로그램으로 정확한 정량을 해줄 수 있다. 데이터 결과값을 통해 T cell내의 특정 gene의 mRNA양을 알 수 있다.(정확한 원리는 나중에 설명) 따라서 지금부터의 과정은 크게 ①RNA isolation ②RNA→cDNA합성 ③qPCR 및 정량 으로 나눌 수 있다. 0. 4℃ centrifuge를 미리 켜둔다. (Cell harvest) 1. 96well plate를 꺼내와서 200p로 파이펫팅 조금 해준 뒤 액체를 모두 따서 새 15ml tube에 옮겨준다. (at.. 201019~21 Mouse splenocyte/T cell isolation + TGF β treat/Cell couting 석사 프로젝트가 바꼈다. TGF-β로 인해서 T cell내에서 Smad6/7의 발현이 epigenetic하게 조절되는지 알아봐야한다. 그래서 mouse의 spleen을 떼서 CD4나 CD8 T cell을 isolation하고 TGF-β를 시간대별로 처리해서 몇몇개의 mRNA leveld을 보기로 했다. Mouse의 spleen에서 T cell을 isolation하는 과정이 생각보다 길고 step도 많다. 1. 500ml비커에 자석을 넣고 1차D.W.로 살짝 헹군 뒤 1차 D.W.를 400ml 채우고 stir기에 올린다. 2. 1에 NaCl 4g / KCl 0.1g / Na2HPO4 0.72g / KH2PO4 0.1g / EDTA 0.146g 각각을 유산지에 계량한 후 넣어준 뒤 비커를 쿠킹호일로 덮어준다.. 201016 Transfection 외부의 gene을 동물cell에 도입시키는 것을 transfection이라고 한다. 일반적으로 gene cloning > transfection > western blotting 순으로 실험을 많이 진행하는 것 같다. 1. -20℃에서 DNA를 꺼내고 multi voltexer에 꽂아 녹인다. 스티로폼 박스에 ice를 퍼온 뒤 철 렉을 꽂고 녹인 DNA와 pei, opti-mem을 ice나 철렉에 꽂아 보관한다. Pei는 zipel 오른쪽 문에, opti-mem은 셀방 앞 냉장고에 50ml tube에 보관 2. Clean bench안에서 새 ep tube 2 set 준비(1set당 sample 갯수만큼) 3. 2set모두 opti-mem을 100ul씩 넣어준다. 4. 1번 set에 pei 8ul씩 넣어준.. 201012~13 Western blotting Transfection시켜서 얻은 sample로 본격적으로 western blotting을 해야 한다. Western blotting은 단계도 많고 시간도 오래 걸리는 실험이니 시간을 넉넉잡아서 하는 것이 좋다. 0. 시작 전 준비: 알루미늄 호일을 깔고 웨스턴 카세트를 준비한다. 카세트 옆구리에 집게를 꽂는다. 1. 15ml tube에 다음 순서대로 넣어준다. 각 용액의 용량은 6% running gel 기준이며 total volume은 10ml이다. ①D.W. 5.3ml + ②아크릴아마이드 2.0ml(위치: 캐리어 냉장고의 갈색병) + ③1.5M, pH 8.8 Tris 2.5ml (위치: 실험대 앞) + ④10% APS 100ul (만드는 법 아래에 설명) // 여기까지 넣었으면 tube 뚜껑을 닫고.. 201009 western blotting sampling 그동안 실험 관련 글을 올리지 못했던 이유는 subcloning이 제대로 안돼서 subcloning만 여러번 반복했기 때문이다. 하다하다 pcr단계부터 다시 시작한 적도 있었다. 그결과 wild type USP6는 어찌저찌 cloning에 성공했지만 mutant USP6_CI(Catalytic Inactive; USP6의 deubiquitylation 효소 기능을 제거한 것)는 아직도 cloning이 안된다. 개빡침. 근데 그와중에 교수님이 다른 프로젝트 하자고 하셔서 그동안 했던건 그냥 없던 셈으로 치게 됐다. 그럴 수 있지.......... 무슨 프로젝트가 됐든 기본적인 실험 테크닉은 계속 익혀야되니 추석이 끝난 후 transfection과 western blotting을 배우기로 했다. Transf.. 200909~200910 cloning효율 높이는 PCR/enzyme cut/ligation 지난번에 시퀀싱 다시 해봤을때도 결과가 영 좋지 않아서 PCR부터 다시 하기로 했다. Cloning의 효율을 높여주는 몇몇 단계를 추가해서 진행했다. 원래대로 진행 원래대로 진행하고 마지막에 incubator에서 반응을 overnight으로 해준다. 1) Enzyme cut 끝난 거에서 DNA purification하기 전 vector에 CIP 1ul를 넣어주고 피펫팅 또는 spin down해준 뒤 다시 37도 incubator에 1시간 이상 incubation시킨다. CIP는 phosphatase의 일종인데, enzyme cut된 vector에 노출된 5'말단의 인산기를 떼어준다. 그러면 vector가 self ligation되는 것을 방지할 수 있다. 3'말단의 OH는 건들지 않으므로 나중에 inse.. 200904 Media 만들기 Cell 배양시 사용할 media를 거의 다 써서 새 media를 만드는 법을 배웠다. 1. 냉장고에서 새 DMEM(500ml), antibiotics5.5(5.5ml), FBS(50ml)를 꺼낸다. (DMEM은 문 옆냉장고, ab랑 fbs는 철냉장고 오른쪽 아랫칸) 2. 모두 water bath에 뎁혀둔다. 3. Clean bench에서 DMEM에 라벨링한 뒤 FBS 50ml, antibiotics 5.5ml를 넣어준다. 넣기 전 inverting을 해주고 넣을 때 병째로 부어준 뒤 남아있는건 피펫으로 옮겨담아준다. Antibiotics는 침전물이 생길수도 있으니 tapping해준 뒤 넣어준다. 4. Media 뚜껑을 닫고 세게 흔들어준다. 그 결과 FBS 9%, antibiotics 1%의 DMEM .. 200904 sequencing 오늘 mini prep과 gel 전기영동을 다시 했고 2개의 DNA sample에서 USP6가 있는 것처럼 보여서 이 두개를 시퀀싱하기로 했다. 시퀀싱은 내가 직접 하는게 아니라 ㅁ크로젠에 주문한다. 1. 보내려는 샘플 20ul을 새 ep tube에 옮겨담고 지퍼백에 담는다. 지퍼백 표면에 아이디, 이름, 전화번호, 샘플수 적어두기 2. dna.macrogen.com 로그인>주문>CES>sequencing service>standard sequencing 3. Sample type: plasmid / 튜브타임: tube 4. 샘플 이름, primer 정보 입력 샘플은 그냥 내가 임의로 지정한 이름을 적어주면 되고 primer는 찾기버튼으로 universal primer를 찾거나 직접 디자인해서 주문할거면.. 200903 Mini prep/enzyme cut/gel electrophoresis E.coli에 transformation을 하고 접종을 끝냈으므로 E.coli에서 vector만 purification을 한 뒤(mini prep) 그 vector가 USP6가 제대로 들어간 vector인지 확인하는 과정(enzyme cut_gel electrophoresis)을 거칠 것이다. Mini prep은 예전에 했던 midi prep과 원리는 똑같고 scale만 다르다. 어쨌든 목적은 plasmid DNA(vector)만을 purify시키는 것이다. 1. 어제 접종해서 incubation 시켜둔 것을 꺼내 down 시킨다. (= Centrifuge ④3000rpm/10min) 그동안 새 ep tube6개, mini prep kit(DNA-spin이라고 써져있는 빨간박스) column 6개 준비,.. 이전 1 2 3 다음
