200909~200910 cloning효율 높이는 PCR/enzyme cut/ligation

지난번에 시퀀싱 다시 해봤을때도 결과가 영 좋지 않아서 PCR부터 다시 하기로 했다.

Cloning의 효율을 높여주는 몇몇 단계를 추가해서 진행했다.

 

 

<PCR> 원래대로 진행

 

<Enzyme cut> 원래대로 진행하고 마지막에 incubator에서 반응을 overnight으로 해준다.

 

<Ligation>

 

1) Enzyme cut 끝난 거에서 DNA purification하기 전 vector에 CIP 1ul를 넣어주고 피펫팅 또는 spin down해준 뒤 다시 37도 incubator에 1시간 이상 incubation시킨다.

 

   CIP는 phosphatase의 일종인데, enzyme cut된 vector에 노출된 5'말단의 인산기를 떼어준다. 그러면 vector가 self ligation되는 것을 방지할 수 있다. 3'말단의 OH는 건들지 않으므로 나중에 insert DNA(USP6)와 반응시켜줄 때 DNA의 5'-p와 vector의 3'-OH는 정상적으로 결합해서 ligation될 수 있다.

 

2) 원래대로 DNA purification(MEGAquick spin plus kit) 진행한다.

 

3) Purification된 vector와 DNA의 농도를 spectrophotometer로 잰다.

 

4) Ligation calculator excel로 DNA와 vector의 size, 농도를 입력하고 엑셀에서 계산해준 양 만큼의 DNA, vector, D.W., buffer, ligase를 새 ep tube에 넣어준다. 그 후 spin down, 16도 incubator에 overnight.

   Ligation calculator는 랩실 선배한테 파일을 받아서 그냥 그걸 썼다.