qPCR primer를 만들어봅시다
1. NCBI에서 qPCR을 통해서 보고자 하는 gene을 검색을 한다. 예시는 PTPN13이라는 gene이다.
2. 종(Species)을 확인하고 클릭
3. protein&mRNA 확인, NM_숫자 클릭 (transcript variant가 여러개인 경우 longest variant인 것으로 선택)
4. FASTA 클릭(형광표시된 부분 클릭)
5. 우측 상단의 Send to 누른 후 fasta file 저장(컴퓨터에 fasta 확장명으로 파일이 저장됨)
6. 써ㅁ피셔 oligo perfect 사이트(apps.thermofisher.com/apps/oligoperfect/#!/design)에서 로그인 후 End-point PCR 클릭
7. Enter sequences in FASTA format에 아까 저장한 fasta 파일 끌어와서 드랍, show parameter 클릭해서 조건 설정(랩실마다 조건이 다를 수 있음), 다 입력했으면 primer design 클릭
8. Status에 초록색 체크표시가 떠서 클릭하면 primer 후보들이랑 sequence가 몇몇개 나옴.
어떤게 qPCR이 잘될지는 해봐야 아는데 테스트해보는 차원에서 여러개 주문하려 한다면 화살표 방향이 서로 겹치지 않게 선택해서 2가지 정도 주문을 해본다. (사진에선 1번 쪽에서 한쌍, 2번 쪽에서 한쌍 고르는 식으로)
9. Primer 골랐으면 blast 사이트에서 primer sequence가 혹시 다른 gene이랑 겹치지 않는지 한번 확인해주는 것이 좋다. Blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 접속해서 nucleotide blast 클릭, Enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence(s)(사진에서 노란색 박스)에 primer의 foward나 reverse sequence 복붙해서 입력 후 blast 클릭
10. 결과 확인, PREDICTED로 시작하는건 크게 신경안써도 되고 primer가 같은 종에 다른 gene이랑 겹치는지(겹치만 안됨!), 내가 보고자 하는 gene이랑은 100% 일치하는지 확인해준다.
