201012~13 Western blotting

Transfection시켜서 얻은 sample로 본격적으로 western blotting을 해야 한다.

Western blotting은 단계도 많고 시간도 오래 걸리는 실험이니 시간을 넉넉잡아서 하는 것이 좋다.

 

 

<Western blotting - Running gel 만들기>

 

0. 시작 전 준비: 알루미늄 호일을 깔고 웨스턴 카세트를 준비한다. 카세트 옆구리에 집게를 꽂는다.

1. 15ml tube에 다음 순서대로 넣어준다. 각 용액의 용량은 6% running gel 기준이며 total volume은 10ml이다.

   ①D.W. 5.3ml + ②아크릴아마이드 2.0ml(위치: 캐리어 냉장고의 갈색병) + ③1.5M, pH 8.8 Tris 2.5ml (위치: 실험대 앞) + ④10% APS 100ul (만드는 법 아래에 설명) // 여기까지 넣었으면 tube 뚜껑을 닫고 막 흔들어준다 // + ⑤10% SDS 100ul(위치: 실험대 앞), voltexing + ⑥TEMED 8ul(위치: 카세트 박스 옆 갈색병), 10p말고 20p로 따는게 편하다, voltexing

   ※10% APS 만들기: ep tube 새 거 꺼내서 저울에 올려두고 0점 맞춤 > 저울 앞 선반대에 APS가루 통을 찾고 작은 숟가락으로 아주 살짝 덜어서 ep tube에 넣어주고 무게를 잰 뒤 10%가 되도록 DW를 넣어주고(예: APS 0.0744g + D.W. 744ul) voltexing한다.

2. 1에서 만든 것이 10ml가 되는지 확인한 후 에이드로 적당히 딴 뒤 0에서 준비한 카세트 틈 안으로 넣어준다. 두번째 선 약간 위까지 넣어주면 된다.

3. 카세트 틈으로 isopropanol을 흘러넘칠 때까지 살살 뿌려넣어준다.

4. 15ml tube에 남은 gel은 집게 틈에 꽂아두고 10~20min동안 굳힌다. tube에 남은 gel이 굳으면 완성된 것이다. 확인 후 tube는 버려도 된다.

5. 싱크대에 카세트에 있는 액체를 버리고 D.W. 물짜개로 틈 안쪽까지 적셔지도록 washing해준다.

6. 티슈로 카세트 겉의 물기를 닦아주고 3M paper 짜투리를 반 접어서 카세트 틈에 넣고 물기를 닦아준 뒤(3M paper가 gel에 안닿게 한다) 카세트를 거꾸로 세워둔다. 

 

<Western blotting - Stacking gel 만들기>

 

7. 새 15ml tube에 다음 순서대로 넣는다. Stacking gel은 western 한 판당 3ml 만든다. 

   ①D.W. + ②30% 아크릴 아마이드 + ③1.0M, pH 6.8 Tris + ④10% APS, tube 흔들기 + ⑤10% SDS + ⑥TEMED

   Tris빼고는 running gel때랑 용량만 다르고 내용물은 똑같다.

8. 7을 에이드로 따서 카세트 틈으로 카세트의 맨 윗 선까지 넣어준다.

9. 카세트에 comb를 꽂아준다. 오른쪽 먼저 끼운 후 나머지 왼쪽을 끼워주는 것이 좋다. 흘러넘친 건 티슈로 닦아주고 15ml tube에 남은 gel은 버리지 않고 보관해두고 tube안의 gel이 모두 굳으면 카세트 내의 gel도 모두 굳음을 확인한다.

 

<Western blotting - Sample boiling>

 

10. Sample boiling 비커에 D.W. 230ml정도 채운 뒤 히터를 키고 올려둔다. 비커는 호일로 덮는다. 끓을 때까지 기다린다.

11. 히터 아래 서랍에서 ep tube 마개를 꺼내서 sample이 담긴 ep tube입구에 끼고 렉에 꽂아 끓는 10에 넣어준다. 5min동안 끓이면 된다.

 

<Western blotting - Gel loading; 약 1h>

 

12. 바닥에 티슈를 두고 9의 물기를 닦고 카세트를 눕힌 뒤 comb를 수평으로 빼준다. Comb에 묻은 것도 티슈로 닦는다.  카세트 바깥면에 붙어있는 스티커도 떼어준다.

13. 카세트를 western blotting 통에 끼운 뒤 통의 흰색 레버를 당겨서 고정한다. 한 통에 카세트 2개를 끼워야 하므로 카세트 하나밖에 없으면 빈 카세트 하나를 따로 끼워준다.

14. 1x SDS buffer(새거)를 카세트 사이에 약간 넘치도록 부어준 뒤 1x SDS buffer(썼던 것)를 카세트 바깥에 부어준다. (카세트 아랫선의 절반정도 오도록 넣어준다.)

15. 막쓰는 1000p로 gel 구멍(wall)을 3번 가량 pipetting해준다. (Gel washing) 이때 주변의 gel이 휠 수도 있는데 먼저 워싱하던거 워싱해주고 휘어진 쪽의 구멍에서 피펫팅 해주면 다시 똑바로 세워진다.

16. 11에서 끓던 sample 꺼내와서 식힌다. (3~5min) 식힌 후 spin down 시킨다.

17. 1x blank sample을 만든다.

     Zipel 냉동실에서 sample buffer를 꺼내서 녹인뒤 spin down시킨 후 sample buffer 200ul + D.W. 100ul

18. Gel loading: [ blank - marker - sample - sample - sample ] ; 10ul씩 loading

     Wall이 총 15개인데 15개 모두 쓸 필요가 없다면 blank, marker, sample을 최대한 중앙에 로딩시킨다.

     Marker는 1x blank sample 5ul먼저 넣은 뒤 marker 5ul를 넣어준다. (marker 위치: 캐리어 냉장고)

19. 뚜껑에 연결된 전선을 꽂고 통에 뚜껑을 덮는다.

20. Set -> voltage로 설정(v), 100V 20min(stacking) 후 200V 40min가량(running)

    그동안 뒷정리를 해둔다. 집게 티슈로 닦고 comb 싱크대에서 물로 씻고 티슈로 닦은 뒤 제자리에 두기.

 

<Western blotting - Transfer buffer 만들기>

 

21. 빈 1x transfer buffer 통 1차D.W.로 두어번 씻어주고 남은 물기를 티슈에 털어서 빼준 뒤 다음 순서대로 넣어준다.

     1차D.W. 760ml(실린더로 계량) + 10x transfer buffer 40ml + methanol up to 1000ml

     넣은 뒤 통을 흔들고 4℃보관

 

<Western blotting - Transfer; 약 2h>

 

22. Membrane 1장(Membrane은 가로길이 5.5cm로 자른다.), 3M paper 2장, 스펀지 5장(oven에 있음)얕은 통 3개(작은 각진통/큰 각진통/큰 둥근통) 준비. 

23. 큰 각진 통에 1차 D.W.를 절반정도 채운다.

24. 작은 각진 통에 메탄올을 넣고 membrane을 넣은 뒤 shaker에 올려둔다.(Methanol activation) 잠시 후 methanol을 버리고 1x transfer buffer 약간을 넣어준다.

25. 큰 둥근통에 1x transfer buffer를 반 쯤 채우고 스펀지 한 장을 넣어서 꾹 눌러주며 적신다. 그 위에 3M paper 1장, 그 위에 24의 membrane을 올린 뒤 핀셋을 올려둬서 고정시킨다.

26. 20을 끄고 흰색 레버를 풀어 카세트를 꺼낸 뒤 끌개로 카세트를 뜯고 알맞는 크기로 gel을 잘라내고 큰 각진 통(23)에 넣는다. Gel의 첫번째 lane이 왼쪽이 되도록 통에 넣는다.

27. Gel을 membrane위에 올리고 밀대로 밀어서 밀착시킨다.

28. 27의 스펀지 왼쪽 위 모서리와 오른쪽 아래 모서리를 잡고 올려서 transfer kit 얕은 면에 올린다.

29. 1x transfer buffer 적신 3M paper를 28의 gel위에 올린 뒤 1x transfer buffer 적신 스펀지 3장을 올린다.

30. 29의 스펀지 뭉치를 들어 살살 액체를 짜주고 뒤집어서 transfer kit 깊은 면 안에 담아준다.

31. 30 위에 1x transfer buffer를 적신 스펀지 1~2장을 키트가 꽉차도록 올려준 뒤 kit 뚜껑을 덮는다.

32. 26에서 카세트를 꺼내고 남은 통을 싱크대에서 물로 씻은 뒤 31의 kit를 통 안에 끼워넣고 1x transfer buffer를 kit 안쪽에 채운다. kit 바깥 부분은 수돗물로 가득 채워준다.

33. 4℃에서 통 뚜껑 닫고 전극 ON (CONST 눌러서 A로 설정, 250mA/120min; voltage 45~52인지 확인)

    끝나면 뒷정리; 통 싱크대에 내용물 버리고 물로 헹궈주기

34. 작은 사각통에 methanol을 넣고 shaker에 올려둔다.

35. 33 끝나면 기계 끄고 통 꺼내서 액체를 싱크대에 모두 버리고 kit에서 스펀지 뭉치 꺼내기 > 한 번 뒤집고 3M paper 벗기기 > gel size따라 3M, membrane 자르기 > 한 번 뒤집고 3M 벗기기> 한 번 뒤집고 34에 membrane만 넣어주기

36. 통, 스펀지 수돗물로 씻고 스펀지는 oven안에 넣기

37. 35에서 사각통의 methanol 버리기, 뚜껑 덮은채로 보관

 

<Western blotting - Blocking>

 

38. 5% skim milk 만들기: 50ml tube에 skim milk 가루 2.5g 넣고 TBST 20~30ml가량 넣은 뒤 voltexing, 50ml까지 TBST로 채우고 shaker에 올려두기

39. 37을 shaker에 올려둔 뒤 methanol 넣어주고(activation) 잠시 뒤(약 10초) methanol

40. 39에 TBST약간 넣고 버려주기(약 10초, washing)

41. 40에 membrane이 잠길 정도로 5% skim milk 넣어주기, 뚜껑 덮기(최소 30min~일반적으로 1h)

 

<Western blotting - Ab 붙이기; 1h~2h>

 

42. HA-HRP 만들기: Skim milk 8ml + AB 2ul (4000:1)

     Ab는 zipel 왼쪽 문가에 ep tube에 보관, stock은 뒷쪽 박스에 앨리컷

43. Flag-Rabbit(1차) 만들기: Skim milk 8ml + Ab 2ul (4000:1) + 2% sodium azide 80ul

     Ab는 쓰기 전 spin down 시키기, sodium azide는 zipel 냉장고에 있음

44. 알맞는 Ab를 만든 뒤 작은사각통에 Ab와 membrane을 넣어준다. (30min)

45. 44가 끝나면 HA-HRP는 버림, Flag-Rabbit은 Ab통에 다시 보관해서 나중에 재사용한다.

46. 사각통에 TBST를 넣고 살짝 흔들어준뒤 버린다. 그리고 다시 TBST를 넣고 shaker에 올려준 뒤 10min 후 TBST를 버리고 새 것으로 갈아준다.(2번 더 반복한다; 총 30min)

47. Rabbit-HRP(2차 Ab): 46의 TBST를 버리고 skim milk 8ml를 넣어준 뒤 2차 Rabbit Ab 1ul (위치: zipel 냉동실)를 넣어주고 shaker 아랫층에 30min 둔다. 끝난 후 액체 모두 싱크대에 버린 뒤 TBST washing 3번(46처럼)

     2차Ab의 양은 보통 1차Ab의 절반을 쓴다.

 

<Western blotting - Detection>

 

48. Detection 카세트(위치: twin 옆 선반)열어서 필름 열고 물짜개로 물뿌린 뒤 닦아주기

49. 싱크대 비커 위의 큰 원형 dish 물기 닦아주기, 휴지 깔아서 수평 맞춰주기

50. 냉장고에서 Lumi-pico 박스 꺼내서 ECL 만들기; 흰색통 800ul + 갈색통 800ul, voltexing

51. Membrane을 tissue에 약간 닦고 원형 dish에 올린 뒤 ECL을 위에 뿌려준다(막쓰는 1000p로), 10~20sec 방치

52. Membrane을 tissue에 약간 닦고 48의 카세트 위에 올려준 뒤 필름을 닫고 카세트 모두 닫는다.

53. 물받이 통에 물을 받고 카세트와 함께 detection방으로 간다.

54. 카세트를 열고 필름 잘라서 얹고 카세트 닫기, 1분 대기, 필름 developer에 넣기(band뜰 때까지), 물에 헹구기, fixer에 넣기(필름 투명해질 때까지)

55. 필름을 물에넣고 나와서 싱크대에서 필름을 물로 헹구고 걸어준다. (blotting 통도 다 씻어준다.)

56. 드라이기로 물기 말리고 카세트에 있는 membrane위에 필름을 대서 protein marker위치를 네임펜으로 찍는다.

57. 필름 다시 물로 씻고 걸어주기.