201009 western blotting sampling

그동안 실험 관련 글을 올리지 못했던 이유는 subcloning이 제대로 안돼서 subcloning만 여러번 반복했기 때문이다. 하다하다 pcr단계부터 다시 시작한 적도 있었다. 그결과 wild type USP6는 어찌저찌 cloning에 성공했지만 mutant USP6_CI(Catalytic Inactive; USP6의 deubiquitylation 효소 기능을 제거한 것)는 아직도 cloning이 안된다. 개빡침. 근데 그와중에 교수님이 다른 프로젝트 하자고 하셔서 그동안 했던건 그냥 없던 셈으로 치게 됐다. 그럴 수 있지..........

 

 

 

무슨 프로젝트가 됐든 기본적인 실험 테크닉은 계속 익혀야되니 추석이 끝난 후 transfection과 western blotting을 배우기로 했다. Transfection을 일정이 안맞아서 어제 사수가 해줬고 오늘 western blotting을 위한 sampling을 배웠다. 정확한 전체 흐름은 다음과 같다.

 

6 well cell culture(이번엔 293T/17 cell) > transfection > (20~24h) > sampling > western blotting

 

6well cell culture에 대해선 다른 글에 쓸 예정이다.

Transfection같은 경우 다음과 같이 6가지를 했다.

 

HA vector / HA-USP6 / HA-USP6_CI

Flag vector / Flag-USP6 / Flag-USP6_CI

 

HA or Flag vector는 gene이 따로 삽입안된 vector로 negative control로 볼 예정이다. 근데 FLAG-USP6_CI가 없어서 우선 이것을 제외한 5개로 어제 transfection을 진행했고 오늘 sampling을 했다.

 

 

 

 

<Western blotting sampling>

 

 

I. Lysis buffer mix 준비

 

0. Ice 퍼오고 철 렉 꽂기

 

1. 4℃ centrifuge 미리 켜두기 (4℃까지 온도를 낮추는데 20min 걸림)

-작동법: 기기 뒤쪽 전원 on > 뚜껑 닫기> Temp아래 눈결정모양 버튼 > start 버튼 

 

2. 냉동실(zipel 문쪽)에서 PI 17, 1M NaF, 500mM NaOV 꺼내서 녹이기 (멀티쉐이커 or 손으로 잡고)

   녹인 후에는 ice 철렉에 꽂아둔다.

 

3. Tube 준비/네이밍

-일반 EP tube 2set, IP tube 1set (1set당 샘플갯수만큼; 이번엔 샘플이 5개니까 1set는 곧 tube 5개 의미)

 일반 EP 1set와 IP 1set는 중간보관용이여서 sampling끝난 후엔 버리고, 나머지 일반 EP 1set는 최종보관용이다.

-naming: cell 이름/DNA이름/날짜 (최종보관용 tube에만 이렇게 정성스럽게 네이밍해줘도됨)

 

4. 냉장고(문 앞)에서 1% triton lysis buffer 꺼내와서 ice에 박기

 

5. 상온(실험대 앞) 1x PBS 꺼내와서 ice에 박기

-1x PBS 없는 경우 제조법: 10x PBS 5ml + 3차 D.W. 45ml > 50ml tube

   10x PBS는 2번째 실험대 앞, 3차 D.W.는 에이포 선반 위에 있음. Tube의 가장 위 투명선이 50ml임

 

6. 15ml 새 tube에 lysis buffer 2ml + PI 80ul + NaF 20ul + NaOV 4ul 넣은 후 voltexing, ice에 꽂기

   한 샘플당 lysis buffer를 300ul 넣어줄 예정이다. 오늘은 총 5개의 샘플이 있으니 1500ul(1.5ml)가 있으면 되지만 이런 mix를 만들 땐 여유롭게 만드는 것이 좋으므로 넉넉하게 lysis buffer 2ml를 준비했다.

   Lysis buffer 1ml 당 PI 40ul / NaF 10ul / NaOV 2ul 들어가게 비율을 맞춰주면 된다.

   (PI는 25x, NaF는 100x, NaOV는500x로 사용한다.)

 

II. Cell 걷어오기; trypsin 사용 + Cell lysis

 

7. DMEM media와 키우던 6 well을 clean bench로 가져온다.

   Cell culture때와 다르게 media는 굳이 미리 water bath에 넣어둘 필요가 없다.

 

8. 6 well 액체 모두 suction

 

9. 한 칸당 PBS 1ml씩 넣어주고 살짝 흔든 후 suction 

   suction을 한 번만 하지 말고 suction을 모두 한번 씩 해준 뒤 약간 고여서 남아있는 PBS를 한번 더 suction해준다.

 

10. 한 칸당 trypsin 600ul씩 넣고 퍼지게 살짝 흔들어준 뒤 incubator에 5min

 

(7~10은 clean bench안에서 진행; 그 이후는 일반 실험대에서 진행)

 

11. 새 15ml tube에 media 5ml정도 덜어두고 clean bench에 나와서 ice에 박아두기

 

12. 10에서 시간 다됐으면 plate꺼내와서 한 칸당 media 600ul씩 넣어준다.

 

13. plate를 살짝 기울인 채 1000p로 액체를 따서 바닥에 돌려가며 쏴준다. 그 후 액체를 3에서 준비한 IP tube에 모두 옮겨 담아준다. 거품까지 다 따서 넣어주는데 거품이 tube밖에 흘러넘치지 않도록 주의해준다.

 

14. IP tube를 4℃ centrifuge에 12000rpm/2min 돌리기

    밸런스 맞추기; 한 tube당 1.2ml로 계산

 

15. 상층액 suction (10p tip으로) 후 ice 철 렉에 꽂기

 

16. 한 tube당 PBS 250ul씩 넣고 200p로 pellet 풀어주기

 

17. 4℃ centrifuge 12000rpm/2min

    밸런스 맞추기; 1tube 당 250ul

 

18. 상층액 suction (10p tip으로) 후 centri에 바로 꽂고 spin down (12000rpm 도달하면 끄기; 밸런스 10ul)

 

19. 남은 액체 깔끔하게 suction (10p tip으로)

 

20. 6에서 만든 lysis buffer mix를 한 tube당 300ul씩 넣고 200p로 pellet 풀어주기

    거품이 잘 생기니까 조심스럽게 풀어준다.

 

21. Voltexing 후 ice 철 렉에 꽂은채로 10min 대기, 10min 지나면 voltexing (3번 반복)

    21과정은 cell lysis시키는 과정인데 3번 반복해서 총 30min 진행한다. 즉 30분 동안 10min마다 voltexing을 해준다고 생각하면 된다. 

 

22. 4℃ centrifuge 13000rpm/10min 돌림

 

23. 그동안 zipel에 4x sample buffer 꺼내서 37℃ incubator에 녹여두기

    Zipel 냉동실 문쪽에 라벨링 안된 보라색 tube임

 

24. 22가 끝나면 상층액만 200ul 따서 3에서 준비한 EP tube 1 set에 옮겨주기

    Tube는 계속 ice에 꽂혀있도록 한다.

 

25. 3에서 준비한 다른 EP tube 1set(최종보관용)에 23에서 녹인 sample buffer 20ul씩 넣어주기

    Sample buffer는 끈적거리기 때문에 파이펫을 끝까지 꾹 누른채로 팁을 넣은 뒤 빨아들이고 tube에 넣을 땐 끝까지 누르는게 아니라 처음 한 번 걸릴 때 멈춘다. (이 방법을 positive pipetting이라고 하고 일반적으로 하는 방법은 negative pipetting이라고 한다.)

    Total volume 60ul가 되도록 할 것이며 sample buffer는 원래 4x이긴한데 랩실에선 3x로 쓴다고 한다. 

 

26. 25에 tube 하나당 24에서 준비한 sample 40ul씩 넣어준다 ; total 60ul / 1 tube

    마지막 거품 하나정도 나오게 꾹 피펫팅해준다.

 

27. Voltexing 후 spin down

 

 

여기까지가 sampling이고 원래 바로 western blotting하면 되지만 다음에 할거면 -20℃에 보관해준다.