201023~28 RNA isolation / qPCR

TGF beta를 친 T cell을 모아서 T cell의 RNA를 뽑아내고, qPCR을 돌려서 gene들의 발현 정도를 확인할 것이다.

qPCR은 mRNA를 cDNA로 합성(역전사)한 뒤 그 cDNA를 가지고 PCR을 돌려서 소프트웨어 프로그램으로 정확한 정량을 해줄 수 있다. 데이터 결과값을 통해 T cell내의 특정 gene의 mRNA양을 알 수 있다.(정확한 원리는 나중에 설명)

따라서 지금부터의 과정은 크게 ①RNA isolation ②RNA→cDNA합성 ③qPCR 및 정량  으로 나눌 수 있다.

 

 

<RNA isolaiton>

 

0. 4℃ centrifuge를 미리 켜둔다.

 

(Cell harvest)

1. 96well plate를 꺼내와서 200p로 파이펫팅 조금 해준 뒤 액체를 모두 따서 새 15ml tube에 옮겨준다. (at clean bench)

   동일한 sample은 한 tube에 모아주면 되고 옮길 때 완벽하게 안따지면 한번 더 따주면 된다.

   T cell은 suspension cell이기 때문이 트립신 처리 없이 이렇게 모을 수 있다. 

2. 1을 centrifuge 1500rpm/6min 후 suction(clean bench 밖)

   이후의 과정들을 포함해서 RNA를 다루는 실험을 할 땐 glove를 꼭 끼고 tip도 새 것을, 파이펫도 에탄올로 닦아주고 사용하는게 좋다. (실험이 민감하다고함)

3. PBS 250ul씩 넣어서 200p로 파이펫팅해준 뒤 새 ep tube에 옮겨준다.

4. 3을 centrifuge 12000rpm/2min/4℃ 후 10p tip으로 suction

5. 4℃ centrifuge로 spin down 후 10p tip으로 깔끔하게 suction

 

(RNA isolation)

6. Trizol을 700ul넣고 200p로 pellet을 풀어준 뒤 5min 대기

7. Chloroform 140ul (chloroform 200ul/trizol 1ml) 넣어준 뒤 15sec 흔들고 3min 대기

   Chloroform은 플라스틱을 녹이기 때문에 미리 소분해두진 않고 쓸 때마다 stock을 꺼내서 필요한만큼 ep tube에 덜어서 쓴다. 파이펫으로 따도 잘 흐르니까 chloroform에 파이펫 팁을 넣은 후 여러번 피펫팅한 뒤에 따주면 된다.

8. Centrifuge 13000rpm/15min/4℃

   그동안 새 ep tube를 샘플 갯수만큼 준비한다.

9. Centrifuge가 끝난 것을 보면 액체에 층이 나눠져있는데 가장 윗 층을 200p로 150ul 설정해서 두어번 따고 새 ep tube에 옮겨준다.

   맨 윗층 부분만 따야하는게 중요. 팁을 뚜껑 입구에 기댄채로 따면 더 편함. 팁이 한번 액체에 들어가면 움직이면 안됨

10. 9에서 옮긴 ep tube에 RNA용 isopropanol 350ul(trizol 넣은 양의 절반)을 넣어준 뒤 파이펫팅(1000p)

    파이펫팅해서 일렁일렁거리는게 보이면 RNA가 잘 뽑힌거임

11. Glycogen을 0.65ul(1000x)씩 넣어준 뒤 1000p로 파이펫팅, 4℃ overnight 보관

 

 

<cDNA 합성>

0. 4℃ centrifuge 켜두기

1. 전날 overnight으로 보관하던거 꺼내서 centrifuge 13000rpm/10min/4℃ 후 10p tip으로 suction

2. Washing; RNA용 75% ethanol 700ul씩 넣어주기

   Pellet이 바닥에 떨어지도록 pellet을 향해 쏘기, 하지만 파이펫팅해서 풀지는 말기

   75% ehtanol: 15ml tube에 DEPC D.W. 2.5ml + RNA용 ethanol 7.5ml

3. Centrifuge 13000rpm/5min/4℃ 후 suction, spin down

   그동안 incubator 55℃로 맞춰두기

4. 200p 파이펫에 200p tip꽂고 그 위에 10p tip꽂은 후 남은 액체 빨아들이고 버리기(pellet 안빨아들이게 조심)

5. Pellet 말리기; ep tube 뚜껑 열은 채로 렉에 꽂아두고 렉을 큰뚜껑으로 덮어두기 until pellet이 투명해질 때까지

6. Elution; DEPC D.W. 20ul씩 넣어준 후 파이펫팅

7. 55℃ incubator에 10min, spin down, ice 렉에 30min

8. 농도재기

   Blank: DEPC 100ul

   Sample: DEPC 98ul + sample RNA 2ul > tapping, spin down

 

(RNA denaturation 과정)

9. DEPC D.W. + dNTP(10mM) 1ul + oligo dT 1ul + RNA sample (at PCR tube) > tapping, spin down

   RNA sample양은 8에서 잰 농도로 계산해서 1ug의 volume만큼 넣어주고 DEPC D.W.는 최종volume=10ul가 되도록 넣어준다. dNTP는 농도가 여러개 있으니 잘보고 넣어준다. (만약 2.5mM짜리를 사용하면 4ul를 넣어주고 그만큼 DEPC D.W.의 양을 조절해준다.) RNA sample의 농도가 낮으면 1ug을 넣어주기 위해 필요한 volume이 많아져서 높은 농도의 dNTP를 사용하게 된다. 내 실험의 경우 농도가 너무 낮아서 RNA sample의 양을 800~900ng밖에 못넣었다.

10. PCR 기기에 tube를 넣고 save protocol > RNA-DENA > RUN > volume 10ul 설정 

 

(cDNA 합성 과정)

11. Premix(1 PCR tube 기준) DEPC D.W. 5.5ul + 5X PSRT buffer 4ul + Prime Script RTase 0.5ul (at ep tube) > tapping, spin down

12. 10이 끝난 후 한 PCR tube당 premix 10ul씩 넣어주고 tube를 꽂은 렉을 책상에 턴다 > tapping, spin down

13. PCR 기기 > save > RNA-SYN > RUN

14. PCR이 끝난 후엔 DEPC 20ul씩 넣어준 뒤 -20℃ 보관

 

 

<qPCR>

0. Primer 녹여두기, ice 퍼오기

1. cDNA mix: (3차 D.W. 11.5ul + cDNA 1ul) 의 비율로 필요한 만큼 ep tube에 만들기 > tapping, spin down ice 보관

2. Primer premix: (3차 D.W. 3ul + primer f/r 각 1ul + SYBR 10ul) 의 비율로 필요한 만큼 ep tube에 만들기 > tapping, spin down, ice 보관

   10개 이상의 분량이 필요하면 실제 분량보다 2개 분량 많게 만들어주기

   SYBR넣은 후엔 200p로 파이펫팅

3. PCR 렉에 qPCR tube를 꽂고 한 tube당 primer premix 15ul + cDNA mix 5ul 넣어주기

   실제로 tube가 많기 때문에 헷갈리지 않도록 조심. 팁을 미리 qPCR 갯수대로 맞춰두면 덜 헷갈림. Premix는 계속 ice에 보관. 최대한 빠르게 진행하는 것이 좋음. Primer premix 넣을 땐 tip을 tube의 아랫쪽 바닥까지 깊숙히 넣고 쏴주고 cDNA 넣을 땐 primer넣을 때보다 윗쪽 벽에 쏴준다는 생각으로 넣어주기

4. Tube 뚜껑 닫아주기(뚜껑 밀어서 닫게 하는 철판이 있음), spin down

5. 쥐방 컴퓨터 세팅, RT PCR 기기 켜서 tube 꽂고 닫기

   > Bio Rad cFX > user defined > (오른쪽 위) CFX 3step Ampt+Melt > edit; Sample volume 20ul, TM 60℃, cycle 44x, 저장 > next > Quick plate 96well SYBR only > next > start run > data file 저장 이름, 경로 설정 > 시작

6. qPCR 끝난 후 데이터 파일

   > gene expression > plate set up > view/edit plate> 칸마다 정보 입력 (target name: gene 이름/sample name: 0~3d/biological group은 안건드림) > experiment setting: reference에 TBP 체크 > ok > melting curve 확인

   Melting curve에서 Cq값 크게 튀는건 우클릭 > well clo > exclude 후 다시한번 전체 비교