201019~21 Mouse splenocyte/T cell isolation + TGF β treat/Cell couting

석사 프로젝트가 바꼈다.

TGF-β로 인해서 T cell내에서 Smad6/7의 발현이 epigenetic하게 조절되는지 알아봐야한다.

그래서 mouse의 spleen을 떼서 CD4나 CD8 T cell을 isolation하고 TGF-β를 시간대별로 처리해서 몇몇개의 mRNA leveld을 보기로 했다.

 

Mouse의 spleen에서 T cell을 isolation하는 과정이 생각보다 길고 step도 많다.

 

 

<Splenocyte isolation용 PBS 만들기>

1. 500ml비커에 자석을 넣고 1차D.W.로 살짝 헹군 뒤 1차 D.W.를 400ml 채우고 stir기에 올린다.

2. 1에 NaCl 4g / KCl 0.1g / Na2HPO4 0.72g / KH2PO4 0.1g / EDTA 0.146g 각각을 유산지에 계량한 후 넣어준 뒤 비커를 쿠킹호일로 덮어준다.

3. FBS 10ml를 녹인 후 2에 넣어준다.

4. 3을 500ml 실린더에 부은 후 비커에 1차 D.W.를 받아서 실린더에 넣어준다. (up to 500ml)

5. 4를 splenocyte용 PBS 유리병에 넣어주고 4℃ 보관

(뒷정리: 실린더 세제로 씻어주기)

 

 

<Ab coating> : splenocyte isolation하기 전 날에 미리 해둬야함

1. Clean bench에서 96well과 mouse CD3 Ab를 준비한다.

2. 15ml tube에 PBS 10ml + CD4 Ab 20ul 후 inverting

96well은 한 칸당 200ul정도 들어감, CD3 Ab(1ug/ul)는 500x로 사용(PBS 1ml당 CD3 Ab 2ug 들어가도록)

이번 실험에서는 96well중 48well만 사용(PBS 200ul*48=9.6ml필요, 넉넉히 10ml준비, Ab 20ug(20ul)필요)

3. 2를 1 well당 200ul씩 넣어주기

4. Parafilm으로 96well plate의 틈을 한바퀴 실링해준 뒤 호일로 싸서 4℃ 보관 overnight

 

 

<Splenocyte T cell isolation>

0. Cell방 centrifuge 4℃로 맞춰두기, RPMI-1640 media, splenocyte용 PBS 준비

 

(1~3: at clean bench)

1. 50ml tube에 mash를 걸고 RPMI media를 10~15ml정도 에이드로 따서 mash에 붓기, 새 50ml tube에 걸러진 RPMI를 에이드로 따서 옮겨주기

96well 중 48well만 사용하게되었고 1well당 200ul 사용하니 media는 약 9.6ml 필요, 넉넉하게 15ml 준비함

2. 1에 143mM 2-betamercapto ethanol을 5.25ul 넣어준다.

143mM 2-betamercapto는 media 50ml당 17.5ul를 넣어주는데 media 15ml를 사용해서 5.25ul 넣어줌

3. 새 ep tube 2개(mouse 마릿수만큼 준비)에 splenocyte용 PBS 1ml씩 넣고 갖고나온다.

 

(mouse prep+T cell isolation); T cell 종류에 따라 자세한 protocol은 다를 수 있음.

4. Mouse 경추탈골, 배 찢고 spleen 찾아서 떼기, spleen을 3에서 갖고온 splenocyte용 PBS에 넣어주고 clean bench로 이동

일단 spleen대충 떼어내서 꺼낸 다음에 spleen에 붙어있는 다른 조직들을 가위로 잘라서 떼어내준다.

5. 새 50ml tube에 splenocyte PBS 소분

(이후의 과정은 1tube(1 spleen)기준; 이날 실험은 2개를 떼어내서 2개의 tube에서 진행함)

6. 새 50ml tube에 mash걸고 4에서 담아온 spleen을 액체랑 함께 mash에 부어준다.

7. 3ml 주사기 피스톤으로 spleen을 mash바닥에 비비면서 으깨준다. 1000p로 splenocyte PBS 여러번 뿌려주면서 으깨준다. 마지막엔 mash바닥에 고인 액체도 파이펫으로 따서 tube에 모아준다.

8. Splenocyte PBS로 up to 20ml까지 부어준다.

9. Centrifuge 1500rpm/6min/4℃ (⑦조건) 후 suction

10. Splenocyte PBS 1ml로 pellet 풀어주기

    풀어주는 과정에서 찌꺼기가 있다면 팁 끝에 묻히고 팁 통째로 버려주면 됨

11. Splenocyte PBS 1ml 더 넣어주고 파이펫팅, splenocyte PBS up to 10ml까지 부어주기, tapping

12. Centrifuge 1500rpm/6min/4℃ 후 suction

13. Ack lysis buffer 1ml 넣어서 pellet 풀어주기

     만약 spleen이 여러개라 tube도 여러개면 먼저 Ack lysis buffer를 1ml씩 넣어준 뒤 pellet을 각각 풀어주면됨

14. Ack lysis buffer 2ml 더 넣어주기(1000p로 두번 넣기), tapping

15. 7min동안 대기하면서 2min마다 tapping

16. Splenocyte PBS up to 10ml까지 부어주기

17. Centrifuge 1500rpm/6min/4℃ 후 suction

     그동안 새 ep tube에 일반PBS 30ul 넣어두고 cell counting plate 꺼내오기

     Zipel 냉동실에서 rat serum 꺼내서 녹여두기

     Centri 후 pellet이 하얘져있어야함, 아직도 빨간색이면 윗단계 더 해야함

18. Splenocyte PBS 1ml 넣어서 pellet풀기, spleen 여러개라 tube 여러개 진행했으면 한 tube에 모두 합친 후 파이펫팅

19. Splenocyte PBS 에이드로 따서 up to 20ml 채워주고 에이드로 풀어주기 (spleen 1개당 up to 10ml필요)

20. 10ul를 따서 17에서 준비한 PBS 30ul tube에 넣고 파이펫팅

21. 20을 10ul 따서 cell counting plate에 뿌리고 cell counting 진행

22. 19 남은건 centrifuge 1500rpm/6min/4℃ 후 suction

     그동안 둥근tube랑 zipel에서 easysep박스(isolation cocktail, rapid sphere있음) 챙겨갖고오기

23. Splenocyte PBS 1ml 넣고 풀어준 후 둥근 tube에 넣어주기

24. Easysep protocol에서 제시하는 cell 농도(1x10^8cell/ml)가 되도록 splenocyte PBS추가로 넣어주기

     ex) 21에서 cell counting한 후 계산한 total cell 양이 1.69x10^8 cell 이면 splenocyte PBS 0.69ml(690ul)를 추가로 넣어주면됨

25. Rat serum 넣어주기 (50ul/ml), 파이펫팅

     24에서 끝난 volume이 1ml일 때 기준으로 50ul 넣어주면됨

     24에서 든 예시는 총volume이 1.69ml이니까 rat serum은 1.69*50=84.5ul 넣어주면됨

26. Isolation cocktail을 protocol에서 제시하는 용량만큼 넣고 파이펫팅 후 RT 10min 대기

27. Rapid sphere 30sec vortex 후 26에 75ul/ml 넣어주기, 파이펫팅, RT 2.5min 대기

     파이펫팅할 땐 1000p tip을 살짝 자른걸로 해주면됨(rapid sphere는 magnetic bead라서 입자가 큼)

     그동안 4℃에서 magnet 꺼내오기

28. 27까지 끝난 둥근tube를 magnet에 2.5min동안 꽂고 기다린 후 새 15ml tube에 내용물 부어주기(둥근튜브가 magnet에 꽂힌 채로 부어주면 됨)

29. Splenocyte PBS up to 5ml 부어주기

30. Centrifuge 1500rpm/6min/4℃

     그동안 Ab coating한 96well plate를 clean bench로 갖고와서 액체 suction 후 일반PBS 200ul씩 넣어주기

 

(T cell을 96well에 넣어주고 TCR activation주기+TGF-beta처리)

31. Centri끝난거 suction 후 일반PBS 1ml 넣어서 풀어준 후 일반PBS 4ml 에이드로 더 넣어준 뒤 풀어주기

32. (for cell couting) 새 ep tube에 일반PBS 30ul + 31 끝난거 10ul 넣은 후 10ul따서 cell couting plate에 뿌리고 count

33. 31 남은거 에이드로 풀고 1well당 cell 개수가 2x10^5개 들어갈 양만큼 새 15ml tube에 옮겨주고 centrifuge 1500rpm/6min/4℃

     ex) 32에서 cell counting한 결과 2.51*10^6cell/ml → 48well 만큼 실험할건데 넉넉하게 50well 분량으로 계산(50x2x10^5=10^7cell 필요) → 31에서 4ml 따오면 약 10^7개의 cell 

34. Centri 끝난거 suction후 RPMI(맨 처음에 mash걸렀던거) 1ml로 풀어준 후 RPMI 9ml 더 넣어주기

35. Anti-MO CD28(농도 1mg/ml) 2ug/ml 필요, 34에서 최송volume 10ml니까 Anti CD28 20ul 넣어주기

36. 96well에 넣었던 PBS모두 suction

37. 35에서 2.5ml를 새 15ml tube에 옮겨담고 TGF-beta(1000x) 2.5ul 넣어준 뒤 파이펫팅

38. 96well 첫 줄에 1well 당 37번을 200ul씩 넣어주기

39. 남은 35번을 에이드로 풀어준 후 다른 well에 200ul씩 넣어주기

40. 96well plate incubator에 넣기

 

 

<TGF beta treat>; 다른 날에 추가적으로 TGF beta treat할때의 방법

1. Clean bench에 TGF beta, cell plate 갖고오기

2. 새 ep tube에 TGF beta 3ul + PBS 27ul, 파이펫팅

   TGF beta(5ng/ml)는 1000x로 사용함. 96well은 media가 1well당 200ul 들어가니까 1well당 TGF beta는 0.2ul씩 필요하지만 파이펫으로 0.2ul는 잘 안따지므로 10배 dilution시키는 단계임

3. Dilution시킨 2번을 1well당 2ul 씩 넣어주고 200p로 두어번정도 파이펫팅해준다.

 

 

<Cell counting>; cell counting의 자세한 단계

1. Pellet을 PBS ⓐml로 푼 후 그 중 10ul를 따서 PBS 30ul(또는 PBS 20ul + trypan blue 10ul)에 희석(4배희석)

2. 희석한 것 중 10ul를 cell counting plate(hemocytometer)에 뿌리고 현미경으로 couting

v		v
v		v

v표시된 부분의 cell 개수만 세어준 뒤 (이때 cell: y개) 평균을 내준다 (y/4)

Hemocytometer는 한 칸의 길이는 각 1mm씩이고 높이는 0.1mm로 부피는 0.1mm^3(=10^-4 ml)이다.

따라서 cell농도를 계산하자면

y * 1/4(평균) *4(희석배수)/10^-4 ml

= y * 10^4 / ml

이다.

Total cell number는 

ⓐ * y * 10^4 개이다.