200812 Plasmid 추출하기(midi prep)

<전체 실험 개요>

 

A. FBXO38 gene이 있는 plasmid를 가진 E.coli를 고체LB배지에 배양해서 single colony를 얻는다.

B. Single colony를 따서 액체LB배지에 접종하고 배양한다.

C. 배양액에서 plasmid만 추출해 얻는다.(midi prep)

D. Plasmid의 FBXO38 gene을 다른 vector에 옮긴다.(subcloning)

E. FBXO38 gene을 옮겨준 새 vector를 cell에 transfection 시킨다.

 

 

 

 

8월 12일 랩실 사람들이 미디~미디~라고 말하는게 뭐하는 건지 알게된 날이다.

생물쪽 실험은 아주 지극정성이 따로없다. 배양만 열몇시간을 하고 미디도 해보니 귀찮고 시간도 오래걸린다.

이렇게 해서 결과보는데 결과 이상하면 정말 빡칠 것이다.

사실 나도 학부 실험수업때 웨스턴 했다가 결과 이상하게 나왔어서.. 진짜 허무했다.

시간을 단축시킬 수 있는 획기적인 프로토콜이나 물질이 개발되면 얼마나 좋을까 싶다.

 

 

C. 배양액에서 plasmid만 추출해 얻는다.(midi prep)

 

 

<Midi prep>

 

1. Incubator에서 삼각 플라스크(액체LB)를 꺼낸 후 냉장고에 넣어둔다.

2. 액체LB를 50ml tube 2개에 나눠 옮긴다. 이 때 접종할 때 넣었던 팁이 tube에 안들어가게 조심한다.

   삼각 플라스크는 8에서 쓸거니까 씻지말고 잠시 둔다.

3. 2개의 tube를 centrifuge 돌린다.(조건: ④3000rpm/10min/RT) ※centrifuge 유의사항은 아래 더보기 클릭

4. 끝났으면 midi후 할 centrifuge를 위해 조건 세팅을 해둔다.(온도를 RT에서 4도로 쿨링해줘야 함)

5. Tube를 꺼내서 액체LB는 버린다. 남은 액체까지 휴지에 탈탈 털어준다.

   Centrifuge를 돌렸기 때문에 바닥에 pellet이 뭉쳐서 붙어있는 모습을 볼 수 있다.(그건 버리면 안돼)

6. RES 용액(랩실 문 옆 냉장고에 있음)을 tube마다 1ml 넣어준 후 피펫팅하면서 pellet을 풀어준다.

   피펫팅할 땐 액체를 너무 끝까지 빨아들이지 말고, 적당히 빨아들이고 pellet을 향해 쏘아주기를 반복한다.

7. 다 풀어졌으면 한 쪽 tube에 액체를 합친 후 RES 6ml를 추가한 뒤 voltexing 해준다. RES는 다시 냉장고에 넣어준다.

8. Midi 시약들을 갖고와서 거치된 순서대로 넣어주면 된다. Midi column은 종이 링을 끼워 삼각 플라스크에 걸어둔다.

   i)LYS 8ml를 tube에 넣어준 뒤 inverting해준다(=뚜껑닫고 위아래로 살살 뒤집어주면서 섞기) 그 후 상온에 5분간 incubation시킨다(=상온에 방치하면됨)

   ii)EQU1 12ml를 midi column 입구를 적셔서 column을 활성화시킨다.

  그냥 피펫으로 내리쬐기보다는 둥근 입구의 겉을 둥글게 돌면서 용액을 살살 적셔준다.

   iii)NEU 8ml를 tube에 넣어준다. 넣고 나면 위가 파랗고 중간에 뿌연게 보이는데 이건 aggregation된 물질들이다. 파란 액체가 투명해질 때까지 흔들어서 섞는다. 잘 섞인 혼합물을 column에 천천히 부어준다. ii처럼 돌리면서 넣을 필요는 없다. Column filter에 여과되면서 column바닥쪽에 plasmid가 걸리고 나머지 액체들은 삼각 플라스크로 떨어진다.

   iv)EQU2 8ml를 column에 돌리면서 넣어준다. (목적: washing) 액체가 모두 나올 때까지 기다려준다. 모두 나온 후엔 column의 filter를 빼서 tube에 넣고 버린다.

   v)WASH midi 8ml를 column에 넣고 다 나올 때까지 기다린다. (목적: washing) 거의 다 나왔으면 잔류한 액체가 모두 나오도록 삼각 플라스크에 탁탁 털어준다.

   vi)새 50ml tube를 꺼내서 column을 옮겨 꽂고 ELU 5ml를 넣는다. (목적: elution) 액체가 모두 나올 때까지 기다리면서 그동안 삼각 플라스크를 씻어준다.(팁도 다 버려준다) 액체가 어느정도 다 나왔으면 잔류한게 다 나오도록 탁탁 털어주고 column을 버린다.

   vii)Iso 3.5ml를 tube에 넣어준다. 넣어주면 tube안이 불투명/투명 층으로 나눠지게 되는걸 볼 수 있다. 그 후 5~6강도로 voltexing을 해준다. 최종 용액volume은 8.5ml가 된다.

9. Centrifuge를 돌린다. (조건: ⑤3500rpm/40min/4도)

10. Suction 진행. 바닥에 깔린 pellet(plasmid 뭉친것)이 안빨리도록 tube를 살짝 기울여서 조심히 한다.

11. 70% 에탄올(15ml tube에 DNA용 에탄올 7ml+D.W. 3ml 섞고 voltexing) 1ml를 pellet에 넣고 ep tube에 옮겨준다.

12. Centrifuge를 돌린다. (조건: 13000rpm/10min/3도) 이 땐 셀방말고 밖에 있는 기계 쓴다.

13. Suction 살짝 해준다. 액체가 약간 남아도 괜찮음. 그리고 spin down(=centrifuge 살짝 돌리는거, start버튼 눌렀다가 n초 후 stop해주면 됨)을 해준다. 그 후 파이펫으로 pellet만 남도록 남은 액체를 제거해준다.(노란 팁에 제일 작은 흰색 팁을 한번 더 꽂아서 사용)

14. Ep tube 뚜껑은 열고 tube 거치대에는 뚜껑을 덮어서 n분간 말려준다. 불투명한 pellet이 투명해질때까지 기다린다.

15. D.W. 200ul를 pellet쪽에 target하면서 넣어주고 피펫팅해준다.

    D.W.의 양은 pellet 양에 따라 달라진다. Pellet이 적으면 100ul 정도, 많으면 200ul 정도.

16. 4도 냉장고에 overnight 보관해준다.

 

Midi manual 책자에도 프로토콜은 나와있지만 일단 정리해놨다 복잡하다..

 

 

 

 

<Centrifuge 유의사항>

Centrifuge를 쓸 땐 무게중심을 맞춰줘야 한다. 10ml짜리 용액 하나를 돌릴거면 정반대 편에 똑같이 10ml짜리 용액을 넣고 돌려줘야한다. 그래서 centrifuge옆에 보면 무게맞추기용으로 물을 채운 tube가 있다. 무게중심을 맞추지 않으면 기기가 고장난다고 한다.

Centrifuge 기기엔 자주쓰는 설정이 저장되어있다. 돌릴 때 저장된 설정을 불러와서 쓰면 된다.

일반적으론 상온(RT)에서 돌리는데 midi같은 경우엔 4도에서 돌리므로 centrifuge를 쓰기 전에 랩실 사람들에게 알린다. 보통 midi하려고 centrifuge를 쓸 땐 2시간정도 셀방의 centrifuge를 4도에 쓴다고 알리면 되는 듯하다.

 

 

<Midi 시약 위치>

실험대 선반에 midi 시약통이 있음. Midi하고나면 시약을 다시 채워줘야한다. 시약통도 없으면 선반 위에 있는 박스를 찾아봐야한다.

RES의 경우 랩실 문 옆 냉장고에 있는데 원래 RES는 상온보관이지만 RNase를 넣으면 냉장보관을 해야한다. 냉장고에 있는 RES는 RNase가 들어간거임.

 

<Midi 시약 작용원리; 확실하지 않으니 다시 찾아보고 수정하기>

-LYS: pH차이를 이용해 세포벽을 깨고 DNA를 푼다. 시약은 염기성.

-NEU: 풀어진 DNA를 다시 뭉치게 함. 크기가 큰 genomic DNA는 aggregation되고 상대적으로 크기가 작은 plasmid는 원래대로의 상태로 존재하게 된다. 시약은 산성.

-EQU, WASH: washing 용도.

-ELU: 염농도 차이로 plasmid를 elution시킴.

-ISO: plamid가 용액에 풀어져있는 상태이므로 물분자가 plasmid를 둘러싸고 있다고 생각하면 된다. 이때 isopropanol이 물분자를 가져가면서 DNA를 침전시킨다.

 

-Midi는 alkaline lysis method를 따르는 것으로 보인다. Alkaline lysis method에 관해서는

https://slidesplayer.org/slide/11233525/

https://slideplayer.com/slide/10390713/

https://thebumblingbiochemist.com/365-days-of-science/minipreps/

참고해보면 좋을 것 같다.

링크는 mini prep에 대해 설명하고 있지만 midi나 mini나 큰 차이는 없고 plasmid의 양에 따라 이름이 달라지는 듯하다.