200811 액체LB만들기/접종하기

<전체 실험 개요>

 

A. FBXO38 gene이 있는 plasmid를 가진 E.coli를 고체LB배지에 배양해서 single colony를 얻는다.

B. Single colony를 따서 액체LB배지에 접종하고 배양한다.

C. 배양액에서 plasmid만 추출해 얻는다.(midi prep)

D. Plasmid의 FBXO38 gene을 다른 vector에 옮긴다.(subcloning)

E. FBXO38 gene을 옮겨준 새 vector를 cell에 transfection 시킨다.

 

 

 

 

8월 11일 랩실 2일차 아직 내가 뭘 해야될지 아무것도 모르겠는 상황이다.

 

A. FBXO38 gene이 있는 plasmid를 가진 E.coli를 고체LB배지에 배양해서 single colony를 얻는다.

B. Single colony를 따서 액체LB배지에 접종하고 배양한다.

 

고체LB plate는 누군가 미리 만들어둔게 있었지만 액체LB는 직접 만들어 써야한다.

전날 streaking한 배지를 incubator에서 꺼낸 후 랩으로 잘 감싸서 냉장고에 보관해두고 액체 LB제조를 진행한다.

 

<100ml 액체LB 제조하기>

1. 100ml 비커에 D.W.를 80ml정도까지만 넣어주고 막대자석도 같이 넣어준다.

   D.W.는 1차수를 쓰면 되는걸로 기억한다(나중에 다시 확인해보기)

2. 선반에 있는 LB가루를 비커에 넣는다.

   LB통에 보면 25.00g/1L라고 써져있다. 우리는 100ml 제조할거니까 LB가루를 2.5g넣어주면 된다.

3. 전자저울에 유산지를 깔고 2.5g 재서 비커에 넣어준다.

   탈탈 털어도 유산지에 가루가 붙어서 잘 안내려올 수 있다. 그럴 땐 D.W.를 흘려주면서 넣어준다.

4. 비커를 쿠킹호일로 감싼 뒤 stirrer에 올리고 작동시킨다.

   Stirrer하단에 보면 밸브가 두 개 있다. 왼쪽은 온도 조절, 오른쪽은 stir 전원이다.

5. 어느정도 stir가 다 되면 D.W.를 더 넣어서 100ml를 맞춘다.

   추가적으로 맞춰줄때는 100ml 실린더로 맞춰준다. (비커내용물을 실린더에 옮긴 후 D.W.채워줌)

6. 100ml 맞췄으면 다시 용액을 비커에 옮겨서 살짝 stir해준 후 삼각 플라스크에 옮겨담는다.

7. 삼각플라스크 입구를 쿠킹호일로 싼 후 autoclave를 돌린다. ※Autoclave 작동법은 아래 더보기 클릭

8. Autoclave에 끝난 후 삼각플라스크를 꺼내서 상온에 식혀준다.

9. 항생제(Ampicillin)을 넣어준다. ※항생제 넣는 법은 아래 더보기 클릭

 

<Autoclave; 고온 고압 멸균>

액체LB 제조 자체는 완성했지만 우리가 원하는 균만 이 배지에서 자라야 하므로 LB내에 존재하고 있을 균들을 미리 다 죽여놓을 필요가 있다. (안그러면 접종시킨 E.coli랑 원래 LB에 살고있던 균들이 같이 무럭무럭 자랄것이다)

일반적으로 autoclave를 이용해 멸균을 진행한다.

배지뿐만이 아니라 다른 멸균이 필요한 실험 도구들도 autoclave를 돌려 멸균할 수 있다.

 

1. 1차 D.W.를 autoclave 아랫층 철 바닥이 살짝 잠길 정도로 부어준다. (약 1.2L정도면 된다.)

2. 윗층에 내가 멸균시킬 것(지금의 경우 액체 LB배지)을 넣고 뚜껑을 닫은 후 밸브를 돌려 꽉 잠근다.

3. 전원키면 알아서 작동한다.

 

Autoclave는 온도는 121도, 압력은 1.5(단위까먹음)까지 상승하여 고온/고압에서 멸균시키는 원리다.

따라서 autoclave가 모두 끝났다고 해도 바로 뚜껑을 열면 안된다. (굉장히 뜨겁고 압력이 높음)

특히 압력이 무조건 0으로 떨어졌는지 확인한 후 뚜껑을 열도록 한다.

안그럼 뚜껑이 폭발하듯 튀어올라 autoclave 바로 옆에 앉은 나와 내 친구가 뚜껑에 맞아 죽을 수도 있다.

급하지 않다면 온도도 7~80도까지 떨어진 것을 확인한 후에 뚜껑을 열도록 한다.

 

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<Ampicillin은 얼마나 넣어야 될까>

 

내 랩실에 있는 ampicillin은 1000x이다. (1000배 농축되어있다는 뜻인걸로 알고 있다.)

우리가 만든 LB는 100ml이고, 여기에 Amp를 넣어서 희석했을 때 1x Amp가 되도록 해야 한다.

즉 원래보다 1/1000의 농도로 만들어줘야한다.

계산을 해보면 대략 100ul 넣어주면 된다.

 

(계산: 1000x Amp를 100ml LB에 a만큼 넣는다 가정했을 때

        농도 = a/100+a = 1/1000

        계산해보면 정확히 a=0.1ml(=100ul)가 나오진 않지만 워낙 작은 양이라 대충 100ul로 쳐줘도 무방함.

        만약 처음 농축배수가 크지 않은 경우(6x라던가..)엔 정확하게 계산해주는게 좋다)

 

 

<Ampicillin은 왜 넣어야 할까>

 

우리가 키우고자 하는 E.coli는 plasmid에 FBXO38 gene이 삽입된 E.coli다. 그런데 모든 E.coli가 이런 plasmid를 가지고 있다고 확신하기 힘들다. 따라서 이를 확인하기 위해 plasmid의 다른 자리에 Amp저항성 유전자를 삽입시켜둔다. 보통 E.coli는 ampicillin이 있는 배지에서 죽어버리지만 Amp저항성 유전자를 가진 E.coli는 ampicillin이 있는 배지에서도 생존한다.

먼저 streaking으로 사용했던 고체LB plate는 ampicillin이 첨가되어있던 것이었고, 액체LB 배지는 처음부터 만들어 쓰는 것이라 제조시 따로 ampicillin을 넣어줘야한다.

 

 

<Single colony 접종하기>

 

액체LB 제조와 멸균을 모두 끝냈다면 냉장고에 고이 모셔놨던 LB plate를 가져온다.

Incubation 끝난 후의 LB plate와 single colony

 

Streaking한 대로 E.coli가 자란 모습이 보일 것이다. 그 중 가장 희석된 부분(마지막쯤에 streaking한 부분)은 선이 아니라 점처럼 자란 것이 보인다. 그 점 하나가 single colony다. Single colony는 하나의 E.coli가 만들어낸 집락으로, 이 single colony에 있는 E.coli는 유전적으로 서로 동일하다고 취급할 수 있기 때문에 single colony를 따서 접종시킨다.

 

1. 피펫에 팁을 꽂고 팁을 살짝 불에 그을린 뒤 single colony를 딴다.

2. 팁을 통째로 삼각 플라스크의 액체 LB에 넣는다.

3. Shaking incubator에 넣고 배양시킨다. 전원만 키면 알아서 온도가 맞춰지면서 작동함. (약 37도/14~15h)

   고체LB plate 배양과 마찬가지로 시간이 오래걸리므로 overnight으로 하는 것이 효율적이다.

   고체LB plate와 다르게 shaking을 해주는 이유는 액체에 배양할 때 흔들흔들해주지 않으면 E.coli가 떡지듯이 뭉쳐지면서 자라기 때문이라고 한다.

 

접종이 끝난 후 고체LB plate는 버리지 않고 다시 랩에 싸서 냉장고에 넣어준다. 혹시라도 실험이 잘못됐을 때 완전 처음부터가 아니라 접종단계부터 실험을 진행할 수 있도록 한다.