201016 Transfection

외부의 gene을 동물cell에 도입시키는 것을 transfection이라고 한다.

일반적으로 gene cloning > transfection > western blotting 순으로 실험을 많이 진행하는 것 같다.

 

<Transfection ; 6 well cell 기준>

 

1. -20℃에서 DNA를 꺼내고 multi voltexer에 꽂아 녹인다. 스티로폼 박스에 ice를 퍼온 뒤 철 렉을 꽂고 녹인 DNA와 pei, opti-mem을 ice나 철렉에 꽂아 보관한다.

   Pei는 zipel 오른쪽 문에, opti-mem은 셀방 앞 냉장고에 50ml tube에 보관

2. Clean bench안에서 새 ep tube 2 set 준비(1set당 sample 갯수만큼)

3. 2set모두 opti-mem을 100ul씩 넣어준다.

4. 1번 set에 pei 8ul씩 넣어준 뒤 tube 뚜껑을 모두 닫고 clean bench나와서 voltexing, spindown한 뒤 clean bench로 돌아와 5min incubation(더 오래걸려도 괜찮음)

5. 2번 set에 DNA를 넣어준다. 5번 할 동안 4번의 incubation이 끝난다. ; 넣는 양은 아래에 표시

6. 1번 set의 내용물을 모두 2번 set 각각에 따서 넣어준 뒤 voltexing, spin down, clean bench에서 15min 대기

7. 키우던 cell 꺼내와서 naming 후 6번을 1000p로 모두 딴 후에 cell에 방울방울 돌아가며 떨어뜨리고 살살 흔들기, 20~24h incubation

 

 

 

Cell plate / DNA, pei양(1:4)	DNA(ug)	pei(ul)
100파이	10ug	40ul
60파이	4ug	16ul
6 well	2ug	8ul

DNA농도는 ep tube에 ng/ul로 표기되어있는 것이 일반적이므로 잘 계산해서 넣어준다.

넣어야할 DNA volume이 0.5ul 이하라면 dilution 할 필요가 있다.

ex) 0.042ul넣어야됨: 100배 dilution(DNA 1ul + opti-mem 99ul) 후 4.2ul 넣기