200904 sequencing

오늘 mini prep과 gel 전기영동을 다시 했고 2개의 DNA sample에서 USP6가 있는 것처럼 보여서 이 두개를 시퀀싱하기로 했다. 시퀀싱은 내가 직접 하는게 아니라 ㅁ크로젠에 주문한다.

 

1. 보내려는 샘플 20ul을 새 ep tube에 옮겨담고 지퍼백에 담는다.

   지퍼백 표면에 아이디, 이름, 전화번호, 샘플수 적어두기

2. dna.macrogen.com 로그인>주문>CES>sequencing service>standard sequencing

3. Sample type: plasmid / 튜브타임: tube

4. 샘플 이름, primer 정보 입력

   샘플은 그냥 내가 임의로 지정한 이름을 적어주면 되고 primer는 찾기버튼으로 universal primer를 찾거나 직접 디자인해서 주문할거면 빈칸을 더블클릭해서 primer 이름을 적어준다. 이번엔 universal primer중 쓸수있는게 없어서 직접 primer를 짜기로 했다.

5. 샘플정보는 공란으로 둬도 괜찮음, primer 타입: 제작 / 시퀀스: 제작할 primer서열 입력

6. 샘플 1개월 보관, 실주문자 정보 입력 후 주문

7. 냉장고 명함으로 샘플 수거 연락, 남은 DNA 샘플은 -20도 보관

 

시퀀싱 한번할 때 보통 700bp까지가 믿을만한 결과가 나온다. USP6는 4221bp의 길이라 못해도 7번에 나눠서 시퀀싱을 해야한다. 그래서 우선 가장 앞 700bp와 맨 뒤 700bp를 시퀀싱해본 뒤 결과가 괜찮다면 나머지 중간을 시퀀싱해보기로 했다.

 

5'(3') -------------------------------------------USP6DNA------------------------------------------- 3'(5')

[P]--앞700bp-->                                                                                 [P]--뒤700bp-->  

 

[P]는 primer를 의미한다. 앞쪽 700bp용 primer는 FLAG 서열로 하기로 했고 뒤쪽 700bp용 primer는 USP6 서열의 뒤에서 700번째쯤에 있는 서열 20개를 하기로 했다. (가장 마지막 서열이 6857번이라 6181~6200번 서열을 primer로 쓰기로 했다)