200902 cell culture

 

Cell stock 푼 것을 이제 culture할 때가 됐다. 정확한 명칭은 subculture라고 한다.

시작하기전에 media는 미리 water bath에 뎁혀두고 현미경으로 cell 상태가 괜찮은지 관찰한다.

Cell을 키울 때 중요한 2가지 요인이 있는데 하나는 nutrient(영양; cell 종류마다 알맞는 media가 다르다)이고 다른 하나는 confluence(공간)이다. Confluence의 경우 cell이 얼마나 빽빽히 자라느냐를 의미하고, culture를 해줄 때 원래 기존 passage의 cell 중 얼만큼을 다음 passage에 넘겨 키울 것이냐를 결정해야한다. 이번에 키우는 cell은 일반적으로 기존 passage의 cell 중 30%가량을 다음 passage로 키우는데 이번엔 cell 상태는 괜찮지만 수가 좀 적은 편이여서 75%를 넘기기로 했다.

Cell은 plate 바닥에 붙어서 자라고 있다. 이렇게 바닥에 붙어있는 cell을 떼어내기 위해 trypsin(adhesion protein을 떨어뜨림)이라는 enzyme을 사용할 것이다. Media의 FBS 성분은 trypsin을 저해하는 성질을 갖고 있으므로 plate에 있는 media를 제거해준 뒤 trypsin을 처리할 필요가 있다. 또 trypsin은 cell에 좋지 않아 나중에 trypsin을 제거하는 과정을 거쳐야 한다.

 

 

<Cell culture>

 

1. Plate를 incubator에서 꺼내온뒤 clean bench에서 plate내 액체 suction (팁은 꼭 plate 바닥이 아닌 벽에 대고 한다)

2. PBS 4ml 넣기(for washing), plate를 살살 흔들어준다

3. 액체 suction

4. Trypsin 2ml 넣고 plate 전체에 퍼지도록 살살 흔들어준다.

5. 37도 incubator에 3min incubation 

6. 그동안 15ml tube 2개 준비, 1개에만 naming, naming안해둔 tube에는 media 5ml 덜어두기

   Media도 contamination을 최소화시키기 위해 피펫 팁은 가급적 안닿게 해주는 것이 좋다. Tip도 모두 autoclave를 돌리고 사용하기는 하지만 tip 보관통 뚜껑을 열어두는 시간이 길다보니 tip은 아무래도 조금 오염되어있을 가능성이 있다. 에이드의 경우 멸균포장된 것을 바로 쓰므로 바로 media통에 넣어도 크게 문제는 없다.

7. 100ㅠ plate 새거 하나 준비한 뒤 naming(cell 이름/passage: P1/오늘 날자/이름)

   Stock 풀었던게 P0이고 한 번 culture해주는거니까 이번껀 P1이다.

8. 5가 다 끝난걸 꺼내온 뒤 6에서 소분한 media 1ml 따서 plate에 뿌려준다.

   Plate를 내 몸쪽으로 살짝 기울여 세운 뒤 plate테두리 따라 둥글게 뿌려준다. 밑에 고인 media를 다시 따서 시계방향, 반시계 방향으로 둥글게 뿌리는 것을 반복한다. 몇번할지는 맘대로지만 되도록이면 횟수를 정하고 앞으로 culture할 때 횟수를 지켜주는 것이 일정한 실험을 하게하는데에 좋다.

9. 8을 다 했으면 액체를 모두 따서 6에서 naming해둔 tube에 옮긴다.

10. 소분한 media에서 1ml를 따고 plate 반시계 방향으로 뿌린다.

11. 소분한 media에서 1ml를 따고 plate 시계 방향으로 뿌린다.

12. 아래에 고인 액체를 모두 따서 6에서 naming해둔 tube에 옮긴 후 그 tube를 centrifuge 돌림. (1000rpm/3min/24도)

     그동안 7에서 준비한 plate에 새 media 10ml를 넣어준다.

13. Pellet 안빨리도록 suction

14. 13에 media 1ml를 넣어주고 피펫팅한 뒤 750ul를 따서 12에서 준비한 plate에 넣는다.

15. Plate를 좌우 상하 대각선 방향으로 흔들어준 뒤 2일(48h)정도 incubation시킨다.