200903 Mini prep/enzyme cut/gel electrophoresis

 

E.coli에 transformation을 하고 접종을 끝냈으므로 E.coli에서 vector만 purification을 한 뒤(mini prep) 그 vector가 USP6가 제대로 들어간 vector인지 확인하는 과정(enzyme cut_gel electrophoresis)을 거칠 것이다.

Mini prep은 예전에 했던 midi prep과 원리는 똑같고 scale만 다르다. 어쨌든 목적은 plasmid DNA(vector)만을 purify시키는 것이다.

 

 

<Mini prep>

 

1. 어제 접종해서 incubation 시켜둔 것을 꺼내 down 시킨다. (= Centrifuge ④3000rpm/10min)

   그동안 새 ep tube6개, mini prep kit(DNA-spin이라고 써져있는 빨간박스) column 6개 준비, naming

2. 1이 끝났으면 tube를 싱크대에 털어서 상층액과 팁을 다 버리고 휴지에도 액체를 탈탈 털어준다.

3. 랩실 안쪽 냉장고에 RES용액을 꺼내서 한 tube당 250ul를 넣어주고 pellet을 피펫팅으로 풀어준 뒤 ep tube에 옮겨준다. 피펫팅할 땐 200p 팁으로 해준다.

   RES를 사용하기 전 RES 통에 RNase v체크를 확인한다.

   피펫팅할 땐 총 용액의 volume보다 적은 양의 volume으로 한다.

4. Kit의 bottle2 lysis buffer 250ul를 각 tube마다 넣어주고 inverting, 1min 대기

   Inverting은 튜브를 위아래로 흔들어주면 된다.

5. Kit의 bottle3 neutralization buffer 350ul를 각 tube마다 넣어주고 inverting.

   Tube입구에 거품이 묻어있을 수 있는데 buffer를 넣어주기 전에 거품을 휴지로 톡톡쳐서 없애준다. 만약 팁에 거품이 닿으면 새 팁을 사용한다.

6. Centrifuge 13000rpm/10min

   Protocol상에는 4도에서 해야되는 것으로 알고있는데 양도 적고 나중에 sequencing보낼 것이라 그냥 상온에서 진행한다.

7. 6이 끝나면 상층액만 미리 준비해둔 column에 부어준 뒤 column을 centrifuge(13000rpm/1min/RT)

8. Filter없는 tube에 내려온 용액 suction

9. Bottle 5 washing buffer B 700ul를 각 column에 넣어준 뒤 centrifuge(13000rpm/1min)

   Buffer 쓰기 전 EtOH v체크 확인한다.

10. Filter없는 tube에 내려온 용액 suction 후 centrifuge(13000rpm/1min)

11. Filter tube를 새 ep tube에 꽂아준다. (Filter 없는 tube는 버려도됨)

12. 3차 D.W. 50ul를 각 column filter 구멍에 조준해서 넣어준 뒤(좀 넘쳐도 괜찮음) 1분간 대기

13. Centrifuge 13000rpm/2min

14. Filter는 버리고 ep tube만 보관한다.

 

바로 enzyme cut할거면 상관없지만 바로 안하고 좀 있다가 할거면 ep tube를 4도 냉장보관한다.

 

 

<Enzyme cut>

 

Mini prep까지 하면 cloning은 다 된것이다. 근데 cloning이 제대로 다됐을지는 확인을 해봐야 안다. 그래서 cloning의 결과물을 일부 따와서 RE로 enzyme cut과 gel전기영동을 할 것이다. 정상적으로 cloning이 되었다면 enzyme cut을 했을 때 vector에서 USP6가 잘려나올 것이고, gel에 내렸을 때 USP6와 vector size의 band가 보일 것이다. 우선 enzyme cut부터 해준다.

 

1. 냉동실에서 cutsmart buffer(10x)를 꺼내와서 녹여주고 incubator를 37도로 미리 세팅해둔다. 새 ep tube 6개 준비.

2. Premix 만들기: D.W. 42ul + cutsmart buffer 7ul + enzyme 각 3.5ul 씩 >> 피펫팅 or voltex + spin down

   한 tube당 D.W. 6ul + cutsmart buffer 1ul + enzyme 각 0.5ul + DNA 2ul (총 vol. 10ul) 를 넣을 것인데 premix는 넉넉하게 tube 7개 분량으로 만들어 둔다. Enzyme은 꼭 마지막에 넣어주고 enzyme을 다룰 때 enzyme있는 부분은 손으로 직접 만지지 않도록 한다(열에 민감함). Enzyme은 지난번에 했던 RE(XhoI과 HpaI)를 갖고옴.

3. 한 ep tube당 premix 8ul + mini prep끝난 DNA 2ul 넣어준 뒤 tapping, spin down

4. Incubator에 약 1시간

 

예전에 enzyme cut할 때랑 enzyme 양이 조금 다른 이유는 vector를 굳이 엄청 많이 자를 필요가 없기 때문이다. USP6를 확인할 수 있을 정도로만 해주면 된다.

 

 

<Agarose gel electrophoresis>

 

이전에 했던 거랑 protocol은 똑같다. 다만 gel을 1%가 아닌 0.7%로 만들었다.

0.7% agarose gel : agarose 0.175g + 1x TAE buffer 25ml

Enzyme cut이 모두 끝나면 spin down시킨 뒤 냉장고에서 loading dye(6x), 1kb marker를 가져온다.

Enzyme cut된 tube엔 loading dye를 2ul씩 넣어주고 spin down시킨 뒤 피펫팅해서 10ul씩 gel wall에 loading한다.

Gel의 가장 윗 wall에는 1kb marker를 loading시키고 전기영동을 시작한다.

전기영동이 끝나면 UV로 결과를 보면 되는데...

그결과 USP6 band는 그 어디에도 관찰되지 않았다... vector band는 뜨는데 USP6 band는 뜨지 않았다... vector는 transformation됐지만.. 그 vector엔 USP6가 insert되지 않았다는 의미일 것이다... 믿고싶지 않다... 그래서 오늘 LB plate에서 다시 colony 따고 접종을 다시 할 예정이다. 6개가 아니라 12개 할 예정이다........

 

Cloning이 잘 안된 이유는 여러가지가 있겠지만.... 일단 HpaI이 blunt end이고 잘 안쓰이는(=선호되지 않는) RE이고 우리 랩실에 있는 HpaI enzyme이 굉장히 오래돼서 품질이 좀 의심이 간다. 또 insert되는 DNA size가 클수록 cloning이 잘 안된다고 한다. 내가 insert한 USP6는 size가 4221bp이였나??그랬는데 여튼 size가 큰 편이였다. 일단 접종 다시 해봐야됨...